大分子物質對中藥注射劑的安全性影響

柯 瑾， 張陸勇， 殷 華， 侯肖霖， 呂小滿， 段為鋼*

(1.云南中醫學院中醫藥學分子生物學重點實驗室，云南 昆明 650500； 2.中國藥科大學新藥篩選中心，江蘇 南京 210009)

從第一支中藥注射劑(Chinese Materia Medica injection，CMMI)“暴潑利爾”(柴胡注射液)問世至今，中藥注射劑的發展經歷半個多世紀[1]。中藥注射劑大多根據其口服制劑上升而來，功效與其口服劑相似。隨著中藥注射劑品種的增多和臨床的廣泛應用，其療效基本得到業界認可，但暴露出的安全性問題依然不容樂觀[2]。中藥注射劑安全性問題背后均存在相應的物質基礎，根據前期分析，提出中藥注射劑殘留的微量大分子物質如蛋白質、縮合鞣質等可能是導致中藥注射劑安全性的重要原因[3-6]。在這一觀點的指導下，本實驗以上市的清開靈注射液和雙黃連注射液為例，從物質基礎和療效毒性方面考察去除大分子中藥注射劑質量是否得到明顯提高。

1 材料方法

1.1 一般材料 HPLC系統型號為安捷倫1100，由安捷倫科技有限公司生產，凝膠成像系統ChemiDoc RX為美國Bio-Rad公司產品，AB204-S電子分析天平為Mettler-Toledo公司產品，Cent 5415D高速離心機為德國Eppendorf公司產品，UV-1600型紫外可見分光光度計為北京瑞利分析儀器公司產品，TECAN多功能酶標儀(Infinity 200 pro+)為奧地利TECAN公司產品。電子紅外耳溫計(IRT 4520型)符合醫用標準，產自美國Kaz USA. Inc.公司。

所用的水為MilliPore超純水系統制得，符合三蒸水標準。3 k、10 k、30 k分子篩(超濾管)為MilliPore公司產品。清開靈注射液(批號100327.2)和雙黃連注射液(批號20100324)均從市場購得，符合《中國藥典》規定。

1.2 去大分子中藥注射劑的制備 將中藥注射劑加入到截留大分子物質的超濾管中，于4 ℃ 3 000 r/min離心獲得超濾，濾液即為去大分子中藥注射劑，同時也獲得富含大分子中藥注射液(上層截留液)。操作過程按照無菌操作進行，獲得的樣品保存在4 ℃或-20 ℃。注射液的固體物測定采用冷凍干燥稱重法進行。精取1 mL樣品，凍干至恒定質量后用分析天平稱定質量計算各樣品的固體物含有量。

1.3 指紋圖譜檢測 清開靈注射液的指紋圖譜檢測按照文獻[7]條件進行，雙黃連注射液的指紋圖譜檢測按照文獻[8]條件進行。進樣量為20 μL。以原始注射液為參照，計算各指紋峰的相對峰面積變化和總峰面積變化。

1.4 外觀質量檢測 將獲得的去大分子注射液和富含大分子注射液裝載在一次性無菌透明塑料試管(10 mL)中，將裝有注射液的試管按一定順序擺放在試管架上，在自然照明充足的條件下進行拍照，觀察各試管顏色變化。另取各樣品30 μL，加入到透明384孔板中，置于TECAN多功能酶標儀掃描400～800 nm的吸收光譜變化。

1.5 清熱作用檢測 清開靈注射液和雙黃連注射液均具有清熱作用。參照文獻方法[9]，選用符合藥典規定[10]的家兔復制脂多糖(LPS)家兔發熱模型。每只家兔經耳緣靜脈注射0.5 μg/kg的LPS(1 μg/mL，用注射用生理鹽水配置)，注射后1 min同耳注射生理鹽水或注射液原液或去大分子注射液，用紅外耳溫計記錄注射LPS前家兔的耳溫，注射LPS后每0.5 h記錄另一耳的耳溫。以注射LPS前的耳溫為參考，計算注射LPS后家兔耳溫的變化。

1.6 一般毒性檢查和過敏毒性檢查 一般毒性檢查按照《中國藥典》2010年版一部附錄91[10]進行，過敏毒性檢查按照《中國藥典》2010年版一部附錄92[11]進行。

2 結果

2.1 去大分子中藥注射劑的指紋圖譜無明顯變化 清開靈注射液原液的指紋圖譜與文獻[7]相似，有4個較明顯的峰，色譜圖參見圖1。將這4個色譜峰進行峰面積積分，以原液的對應峰為參照，計算去大分子注射液的相對峰面積，結果參見表1。將原液色譜圖的總峰面積為參照，計算去大分子注射液的總的相對峰面積。

圖1 清開靈注射液指紋圖譜

雙黃連注射液原液的指紋圖譜與文獻[8]相似，有6個較明顯的峰，色譜圖參見圖2。將這6個色譜峰進行峰面積積分，以原液的對應峰為參照，計算去大分子注射液的相對峰面積，結果參見表1。將原液出峰的總峰面積為參照，計算去大分子注射液的總的相對峰面積，結果參見表2。

表1 清開靈注射液和雙黃連注射液主要峰峰面積變化

表2 兩種中藥注射液去大分子物質和總峰面積變化

圖2 雙黃連注射液指紋圖譜

結果表明，兩種中藥注射液去除大分子物質后，指紋圖譜未見質的改變，但3 k分子篩選處理的單個峰面積變化較大。結合單個峰面積(表1)和總峰面積(表2)變化，得知截留去除10 k分子量后獲得的中藥注射劑的指紋圖譜變化最小，相對總峰面積大于0.95(表2)。

2.2 去大分子后能明顯提高中藥注射劑的外觀質量 將兩種中藥注射劑原液、去除大分子中藥注射液和富含大分子注射液裝在10 mL透明塑料試管中，排列在試管架上拍照，參見圖3。各截留液來自4倍體積的原液。圖3結果表明，濾過液的顏色均較原液淺，以3 k濾過液顏色最淺；而截留液以3 k截留液(富含大分子)顏色最深?？梢姽庾V掃描結果(圖4)也證明去除大分子物質后能改善中藥注射劑外觀質量。

2.3 去大分子中藥注射劑主要療效無明顯下降

2.3.1 去大分子清開靈注射液的清熱試驗結果 0.5 μg/kg的LPS能誘發家兔發熱，約1 h到高峰，維持約4 h，4 h后體溫趨向恢復。清開靈注射液原液和去大分子注射液均有一定的體溫降低作用，并有大體的量效相關性。經多因素方差分析，去大分子注射液的解熱作用總體上略優于原注射液(P<0.05，雙因素方差分析)，參見圖5。

2.3.2 去大分子雙黃連注射液與原注射液的清熱試驗結果 0.5 μg/kg的LPS能誘發家兔發熱，約1.5 h到高峰，維持約3.5 h，隨后體溫趨向恢復。雙黃連注射液原液與去大分子注射液均有一定的降體溫作用(P<0.05)。去大分子注射液的解熱作用不低于原注射液，參見圖6。

2.4 去大分子中藥注射液的安全性

2.4.1 清開靈注射液去大分子后安全性提高試驗結果 按照《中國藥典》2010年版一部附錄91[10]要求配制以上7種來自清開靈注射液的樣品，取符合要求的35只小鼠隨機分為7組，每只小鼠腹腔注射0.5 mL，觀察20 min，結果發現注射清開靈注射液原液、清開靈注射液10 k分子篩濾液、清開靈注射液30 k分子篩濾液樣品的小鼠未見明顯變化，而注射了清開靈注射液10 k分子篩截留液(源自10倍體積原液，固體物含有量0.062 2 g/mL)和30 k分子篩截留液(源自10倍體積原液，固體物含有量0.051 6 g/mL)樣品的小鼠分別有5、4只發生扭體反應。表明富含大分子組分中藥注射劑的安全性較低，從而間接表明去除大分子物質后的注射劑安全性得到提高。因當前實驗只能將3 k截留液濃縮4倍(相當于從100 mL原液截濾制備25 mL截留液)，未觀察到陽性結果。

從左至右依次為原液、3 k濾過液、10 k濾過液、30 k濾過液、3 k截留液、10 k截留液和30 k截留液；截留液均來自4被體積的原液

Q0.原液 Q1.3 k濾過液 Q2.10 k濾過液 Q3.30 k濾過液 S0.原液 S1.3 k濾過液 S2.10 k濾過液 S3.30 k濾過液

注：NS為生理鹽水，給藥量1 mL/kg；“清開靈”為清開靈注射液的原液；“處理”為10 k分子篩去大分子清開靈注射液。0.75、1.5、3 mL/kg分別指給藥體積。

注：NS為生理鹽水；“雙黃連原”為雙黃連注射液原液；“雙黃連去”為10 k分子篩去大分子雙黃連注射液。給藥體積：1 mL/kg。

2.4.2 雙黃連注射液去大分子后安全性提高試驗結果 按照《中國藥典》2010年版一部附錄92[10]進行過敏反應檢查。按照附錄92要求配制以上4種來自雙黃連注射液的樣品，取符合要求的24只豚鼠隨機分為4組，每只豚鼠隔天腹腔注射0.5 mL，共注射3次，以后正常飼養。第14天靜脈注射以上樣品各0.5 mL，結果30 min內發現注射雙黃連注射液原液、雙黃連注射液10 k分子篩濾液樣品的豚鼠未見明顯變化，而注射了雙黃連注射液10 k分子篩截留液(源自10倍體積原液，固體物含有量0.026 6 g/mL)和雙黃連注射液30 k分子篩截留液(源自10倍體積原液，固體物含有量0.023 1 g/mL)樣品的豚鼠分別有3只呈現明顯的過敏反應(豎毛、發抖)。表明富含大分子組分中藥注射劑的安全性較低，易導致過敏反應，從而間接表明去除大分子物質后的注射劑安全性得到提高。

3 討論

近年來，中藥注射劑的安全性是業界關注的主要問題之一。盡管中藥注射劑的安全性問題的解決是一個系統工程，涉及到標準、生產、流通和使用等環節[11-14]；但根據中藥注射劑現階段的生產特點和標準要求，我們認為其核心環節應該是標準制定環節和生產環節[15-16]。由于標準與生產直接相關，因此中藥注射劑的安全性問題本質上是生產方面的質量問題。中藥注射劑的安全性是有物質基礎的[4]，根據前期分析，現階段首要控制的就是中藥注射劑的大分子物質。根據此指導思想，我們采用分子篩處理兩種以往市場流通較多的兩個品種，將獲得的去大分子注射液和富含大分子注射液分別進行試驗，結果表明通過一定分子篩處理，可以在保證療效的前提下提高其安全性。

清開靈注射液和雙黃連注射液均具有清熱解毒之功效，臨床用量較大，也是引發安全性問題頻次較高的注射劑[15，16]。前期研究表明，該實驗所用的兩種注射液含有微量大分子(蛋白質和縮合鞣質)[5, 17-19]。本研究發現去除一定大分子物質后，注射劑的指紋圖譜會發生改變[5，19-21]，截留分子量越小，對指紋圖譜的影響越大。理論上，分子量大于3 000的成分不可能成為中藥注射劑的活性成分，截留3 k分子量獲得的新注射液應當有更高的安全性，但由于對指紋圖譜的改變較大，提示可能嚴重改變了中藥注射劑的物質基礎，從而嚴重干擾療效。由此推測，截留分子不宜過小。根據我們的研究結果，截留分子量在10k左右值得推薦，因為指紋圖譜各峰的改變量較小，改變總量在5%以內，而且療效(清熱作用)基本不變或略有提高，但安全性卻明顯提高。

中藥注射劑安全性提高的直接證據很難獲得，因為上市注射劑是符合藥典規定的，采用藥典方法很難直接證明其安全性更高。本研究則采用“反證法”證明之，即：根據“大分子不是傳統意義上中藥注射劑的有效成分”這一觀點，采用分子篩富集中藥注射劑中的大分子物質，證明富集的大分子物質具有明顯的“毒性”，從而間接證明去除大分子物質的中藥注射劑則安全性明顯提高。由于在實驗中發現，3 k分子篩容易阻塞，很難將大分子物質富集到10倍，而且3 k分子篩處理的藥液指紋圖譜改變較大，因此沒有考察此類富含大分子注射液的安全性和去大分子注射液的有效性或未獲得較好結果。

根據原料來源，中藥注射劑主要有兩類，一類是以揮發油成分為主的注射液如魚腥草注射液，另一類是以固體物為主的注射液。前者多采用水蒸氣蒸餾法制得，理論上不含大分子物質(暫不考慮輔料)，后者多采用“水醇法”提取制得，理論上可以提取到微量大分子物質，實際上也能提取到大分子。本研究中的兩種中藥注射劑屬于后者。對于“水醇法”提取制備的中藥注射劑而言，本實驗結果提示，去除一定的大分子物質，能夠在保證有效性的前提下提高中藥注射劑的安全性。

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