甲狀旁腺素與維生素D檢驗在骨質疏松癥中的應用進展

劉海燕 王華新 李偉娜 季靜

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是一種以骨量降低和骨顯微結構破壞為特征，導致骨脆性增加和易發生骨折的代謝性骨病。我國患OP的人口約有8 000萬，發病率為6.97%，2010年世界骨質疏松日警告說2020年我國將超過2億人受到骨質疏松癥和骨量減少的影響。在診斷與治療OP中，臨床常用骨密度(BMD)檢測和生化指標檢測(激素、骨鈣素、骨性堿性磷酸酶、I型膠原交聯降解產物、骨礦物)。激素檢測主要包括甲狀旁腺激素(PTH)、維生素D和降鈣素(CT)，其中甲狀旁腺激素(PTH)、維生素D在維持鈣動態平衡中起重要作用，在診斷與治療、監測OP中應用較廣。

1 甲狀旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)

PTH是由甲狀旁腺的主細胞和嗜酸性細胞合成含有84個氨基酸的直鏈多肽，分子量為9 500。在血液循環中，存在PTH原(pro-PTH)及前PTH原(pre pro-PTH)、iPTH(完整 PTH)、N 端 PTH、PTH1-34、C 端PTH、PTH7-845種主要PTH形式。PTH及其代謝物由腎臟排出體外，在腎衰竭患者血清中PTH成分更加復雜，Lopez等［1］通過選擇反應監測法(SRM)還可檢測到 28-84、34-84、37-84、38-84、45-84、48-84、34-77、37-77、38-77、1-13、7-13、14-20、28-44、34-44、73-80 等片段。PTH主要受血清鈣離子和1，25(OH)2D3調節，當血鈣濃度在3.75～5.2 mmol/L時，PTH分泌與血鈣呈負相關，當1，25(OH)2D3不足時可激發甲狀旁腺功能亢進，增加骨轉換加速骨流失［2］。

臨床實驗室主要以檢測PTH1-84為主，經歷了RIA、IRMA和 CLIA(或 ECLIA)技術更新。近來，Claudon［3］首次報道了蛋白陣列芯片技術(roche diagnostic GmbH)，可同時檢測四種骨代謝標志物(CTX-I、PINP、OC、iPTH)。

1.1 臨床檢驗

1.1.1 準確度:Roch Elecsys 2010精密度較高，批內批間CV可在6%以內，與蛋白陣列芯片技術大致相同。Roch Elecsys 2010 檢測限值分別為 1.2 μg/L，定量限值分別為4.9 μg/L;蛋白陣列芯片檢測限值與定量限值分別為 0.39 μg/L、3.32 μg/L。

1.1.2 干擾因素:①PTH不同片段對測定影響 Sukumar比較了3種ELISA法、2種IRMA法和CLIA法測定iPTH結果，結果顯示方法之間檢測結果差別很大，即使同一種方法差別可達2倍以上，因此，對PTH的檢測急需標準化，方法間沒有可比性，同一方法也不能相互比較，這是因為PTH各個片段對PTH1-84測定存在干擾［4］。②藥物對測定干擾 以生物素-鏈霉素為檢測技術如Roch Elecsys 2010檢測iPTH時，生物素可能對檢測結果有干擾。Meany等［5］曾檢測一患有無動力性腎性骨病64歲女性的患者血清(漿)iPTH時，Elecsys 2010結果(48 vs 786 ng/L)明顯低于Immulite 2000(DPC)，后經調查和實驗證實，患者服用了生物素，對檢測結果造成了嚴重干擾。③血糖也是影響PTH因素之一，HbA1c控制在5% ～6%的糖尿病iPTH比控制在7%～8%者iPTH明顯增高。

1.1.3 標本采集:①標本穩定性:Stokes等［6］分別采用肝素鋰、EDTA及普通采血管采集18例骨代謝疾病患者血液，在Roche E170測定iPTH和其他骨代謝標志物。結果顯示，肝素鋰、EDTA抗凝全血在室溫可保存至8 h和48 h，血漿可在室溫穩定至28 h，2～8℃可穩定至28 d;而iPTH應采用含肝素或EDTA采集管采集，若采用血清標本應及時測定。②采血管:國內學者發現Immulite測定iPTH，當EDTA-K2高于6 mmol/L時，影響了堿性磷酸酶活性而導致iPTH測定不準確，而韓國Kim采用濃度約為5 mmol/LEDTA鹽時可有效地絡合金屬離子如鋅、鈣、銅等，降低離子依賴性金屬蛋白酶的活性，從而阻止蛋白水解酶對PTH的降解作用。Holmes發現EDTA管測定值高于 SST(促凝膠管)。③Twomey證實ADVIA檢測系統檢測腎衰竭患者血清和血漿之間PTH存在25%的差別。

1.2 臨床應用 (1)PTH是維持血鈣正常的最重要的激素，當血鈣濃度發生變化時，PTH比降鈣素和1，25(OH)2D3反應更靈敏，小劑量PTH可刺激成骨細胞形成新骨，而大劑量時則導致破骨細胞增值，骨重吸收增強，血鈣升高。甲狀旁腺功能亢進是OP常見病因之一，Tannenbaum等［7］檢測173名絕經后女性OP患者中PTH升高者達15.6%，并建議臨床實驗室應將血清鈣、PTH、24 h尿鈣(應用甲狀腺替代治療者增加檢測TSH)作為基本檢測項目，以對OP病因進行評估。(2)臨床診斷OP時，當血鈣異常為查找原因常檢測PTH，而當血鈣正常時，通常不常規檢測PTH，但血鈣正常PTH也有升高現象。在應用二磷酸鹽類藥物治療OP時，由于抑制破骨細胞的作用，使得血鈣減低，PTH分泌增加，血中PTH輕度升高，同時激發VitD合成增加［8］。(3)因季節更迭、人種、年齡等不同PTH可發生變化。非西班牙籍黑人、墨西哥-美國后裔PTH偏高，而白色人種偏低，其他人種居中，如Aloia等［9］建立美國黑人女性PTH臨界值為38 pg/ml，而白人女性為35 pg/ml;身體質量指數增加PTH也增加;吸煙、飲酒、補充Vit D均可降低PTH。夏、秋季PTH低于冬季，運動后會降低PTH，隨著年齡增長PTH也增加。

2 維生素D(Vitamin D，VitD)

人體內來自食物的VitD不足10%，90%以上VitD由7-脫氫膽固醇在皮下經日光照射后，經肝25-羥化酶作用下，轉化為25OHD3，后者在腎臟進一步羥化轉化為1，25(OH)2D3。體內VitD活性成分有1，25(OH)2D3、25OHD3、24，25(OH)2D3，其 中 1，25(OH)2D3活性最強，但因25OHD3具有含量高、具有較好穩定性(可穩定約2周)以及能更靈敏地反映出VitD缺乏或過多等特性，而被認為是反映VitD營養狀態的更好指標［10］，但腎功能衰竭、肉瘤病和肉芽腫病時應增加檢測 1，25(OH)2D［11］。

臨床實驗室主要以檢測25OHD為主，經歷了放射性競爭性蛋白結合法(CPB)、RIA和高效液相色譜法(HLPC)及化學發光法(CLIA)，目前應用最廣的有CLIA和LC-MS/MS(液相色譜-質譜/液相色譜法)。

2.1 臨床檢驗

2.1.1 準確度:如Liaison全自動發光儀檢測25OHD采用直接競爭免疫發光分析，可檢測25－OHD2和25－OHD3，批內 CV 為 9.1% ～21.2%，批間為 CV 14.0%～34.1%，分析靈敏度為5 nmol/L。LC-MS/MS等色譜法可將檢測 25-OHD2、25-OHD3及 1，25(OH)2D3、1，25(OH)2D2等其他成分，因而更具有特異性［12］。

Binkley等［13，14］曾于 2003 年和 2012 年調查美國臨床實驗室測定25OH-D的情況。2003年由于各個實驗室采用的檢測不同(主要包括RIA、CLIA和HPLC法)，結果間差異顯著(最高值是最低值的2倍之多)，給臨床帶來極大困惑，因此呼吁，急需臨床實驗室進行方法學規范管理，制定統一國際化標準品，當時提醒臨床醫生不要將檢測結果作為診斷VitD缺乏或不足的可靠指標。2012年，研究者將25個血清標本分發給7個實驗室，分別采用LC-MS/MS(液相色譜-質譜/液相色譜法)、免疫分析法(Diasorin Liaison CLIA)測定，以LC-UV(液相色譜法)為參照，檢測結果經Bland-Atman分析后認為，三種方法檢測結果相關性較好(r2=0.87～0.97)，但LC-MS/MS存在系統誤差呈一定比例增高，免疫法結果存在隨機誤差，究其原因是由于各個實驗室使用校準品不統一、干擾因素較多、批內批間變異較大所致。

2.1.2 干擾因素:①Vit D水平受鈣離子濃度、PTH水平、測定方法的影響較大。VitD、PTH共同協調作用控制鈣離子濃度動態平衡，同時鈣離子濃度也反饋調節Vit D和PTH。在建立VitD參考區間時，應同時檢測PTH和鈣離子濃度。而Dawodu等［15］認為，在妊娠期PTH與25OHD這種協調關系不強。由于檢測VitD位點的不同，如免疫學方法Liaison 25OHD檢測的不僅是25-OHD2還包括25-OHD3，而色譜法可特異性檢測二者之一。②VitD結合蛋白(DBP)影響。Al-oanzi等［16］通過對骨質疏松癥患者 25(OH)D3和 1，25(OH)2D3測定，發現骨質疏松癥患者中總25(OH)D3和1，25(OH)2D3濃度與正常人差異不顯著，而DBP顯著升高，如經公式:〔F〕≈〔T〕/KaDBP〔DBP〕計算后具有生物活性的游離25(OH)D3和1，25(OH)2D3比正常人顯著降低，因此建議在檢測VitD時應考慮DBP的干擾作用。

2.1.3 參考區間:VitD缺乏或不足導致腸道對鈣磷的吸收能力下降，導致低鈣血癥，可反饋激發PTH分泌增加，造成繼發性甲狀旁腺功能亢進，骨鈣釋放增加，骨量減少，骨密度降低從而導致骨質疏松癥。臨床檢測VitD主要為了解營養狀況，預防OP的發生，而很少用于OP的診斷［17］。①關于VitD參考區間觀點不一，美國醫學會建議健康人血清25OHD水平不低于50 nmol/L，而內分泌學會建議正常人血清25OHD水平不低于75 nmol/L。Hanley等［18］學者建議診斷VitD缺乏或不足診斷cut-off值。見表1。②母體缺乏VitD對胎兒及自身影響極大，主要表現為出現低體重兒、胎兒骨密度降低及體長縮短、胎兒死亡率增加，嚴重者出生后可造成佝僂病、軟骨病;孕婦缺乏VitD易患妊娠糖尿病、先兆子癇、剖宮產等。一般建議孕婦25OHD參考區間應為 50 nmol/L 以上［15］。中國 Wang等［19］采用1997年美國食品和營養委員會制定標準制定標準:25OHD＜25 nmol/L為VitD缺乏，25～50 nmol/L為不足，高于50 nmol/L為正常。Holick［20］建立兒童25OHD 參考區間為 25 ～137 nmmol/L。Cashman［21］建議25OHD水平低于12.5 nmol/L兒童患佝僂病的風險極大，而低于50 nmol/L罹患心血管疾病、自身免疫病及癌癥的風險較大。③VitD受季節、緯度、膚色、年齡、日照時間、服裝、飲食習慣及營養供應等影響較大。冬季最低，夏季最高，隨日照時間延長而增加;如北緯35°以上地區冬季太陽光入射角太小，大多數紫外線B被臭氧層吸收，皮膚合成VitD能力降低。白種人VitD最高，黑種人VitD最低，而其它膚色人種居于中間，由于PTH與VitD具有負相關性，也與膚色有很大關聯，如黑人女性臨界值為25(OH)D為37 nmol/L，而白人女性為 59 nmol/L［7］。Ogan 等［22］調查發現運動并不能提高VitD水平，但長期戶外運動者比戶內運動者VitD水平明顯增高。

表1 VitD缺乏或不足Cut-off值

2.2 臨床應用 (1)VitD不直接作用于骨的形成或重吸收，但對腸道對鈣的吸收具有重要促進作用，當Vit D缺乏時，血鈣濃度降低將導致PTH分泌增多，破骨細胞被激活，導致溶骨、骨鈣大量釋放。OP患者常檢測25OHD用于監測VitD水平，以決定進一步治療方案。Wlfl等［23］對54例骨折患者在第一治療期8周跟蹤觀察，發現低BMD和正常BMD患者25OHD無顯著差異，并且在治療前后亦無顯著變化，PTH雖在治療前后無顯著變化，但低BMD者PTH略高于正常BMD患者，并提出25OHD和PTH不是骨折后治療監測骨量發生變化指標，應尋求其他更可靠的指標。(2)對人群VitD營養狀況評估:Wahl等［24］對全球46個國家年齡在1歲以上人群VitD狀況進行分析，幾乎全球的兒童及除瑞典、泰國等少部分東南亞國家或地區成人外，都存在程度不等的VitD不足或缺乏。我國兒童VitD營養狀況不容忽視，各地區檢測均值僅為25.5 ～33.4 nmol/L(年齡1 ～14 年)，成人均值為31.7～43.9 nmol/L(年齡19～70歲)。

OP是老年人尤其絕經后女性常見病，易發生骨折甚至危及生命，臨床醫生診斷OP最常用的“金標準”是BMD。建議臨床實驗室將血清鈣、PTH、24 h尿鈣(應用甲狀腺替代治療者增加檢測TSH)作為基本檢測項目，以對OP病因進行評估，即可減少漏診又可以節約醫療資金。在應用時應注意方法學的選擇、采血管選擇和標本穩定性以及某些因素對測定結果的干擾，還要注意因人種、年齡等參考值有所不同。VitD不是臨床醫生診斷OP常規檢測項目，可用于病因分析和后期治療方案的選擇，但由于在不同檢測方法學檢測結果差異較大，難以統一規范化國際化標準品，以及Cut-off值的設定具有分歧等原因，臨床實驗室面臨著極大挑戰，但值得肯定的是全球VitD缺乏的形勢十分嚴峻，應引起臨床醫生、CDC等部門關注。

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