托吡酯致小鼠胚胎毒性及葉酸干預的實驗研究

鄭麗娜 李云霞 闞淑娟 王春艷

癲癇是一組由大腦神經元突然異常放電所引起的短暫大腦功能失調的慢性綜合征，具有突然、反復發作的特點［1］。癲癇是妊娠期女性需要持續治療的最常見神經系統疾病［2］。癲癇女性妊娠期間的病情往往比未妊娠期加重，死胎或新生兒死亡的發生率升高，早產兒和畸形兒的發生率增加，孕產婦的死亡更加常見［3－5］。我國每年有(3～4)/萬的新生兒來自患有癲癇疾病的母親，癲癇孕婦后代畸形發生率高于正常女性的2～3倍［1］。抗癲癇藥物(AEDs)是目前治療癲癇最常用和最重要的手段，其安全性越來越受到廣泛的關注。有研究表明，所有的AEDs均具有不同程度的致畸作用［6］。新一代抗癲癇藥托吡酯(TPM)以其多重的藥理作用在臨床實踐中表現出明顯的治療效果［7］，但其對胚胎的發育是否有毒性作用無相關報道。本實驗以小鼠為研究對象，觀察TPM的胚胎毒性作用及葉酸(folic acid，FA)的干預效應，從而為臨床上服用TPM的生育期女性安全用藥提供動物實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級昆明種小鼠，由北京華阜康生物科技股份有限公司實驗動物中心提供。合格證號:SCXK(京)2009-0004。雌性體重(21.8 ±1.7)g，雄性體重(22.6 ±1.8)g，自然光照，自由飲水進食，適應性飼養七天。TPM(西安楊森制藥有限公司，25 mg/片，批號:090724035)，FA(北京北大藥業有限公司，每片0.4 mg，批號:S090528);兩種藥物用蒸餾水配制成所需濃度。

1.2 動物分組及給藥 按雌雄比例2∶1合籠交配，次日清晨定時檢查雌鼠陰栓，以查見陰栓者為妊娠零天，并隨機分為5組，每組20只孕鼠。分別為:(1)空白對照組:每天灌胃蒸餾水，容量為10 ml·kg－1·d－1;(2)TPM 低劑量組:40 mg·kg－1·d－1經口灌胃;(3)TPM 高劑量組:80 mg·kg－1·d－1經口灌胃;(4)TPM低劑量 +FA 組:TPM40 mg·kg－1·d－1經口灌胃，同時添加 0.7 mg·kg－1·d－1FA;(5)TPM 高劑量 +FA組:TPM80 mg·kg－1·d－1經口灌胃，同時添加0.7 mg·kg－1·d－1FA［5 組給藥劑量均相當于成人等效劑量的10倍(成人按60 kg)］。5組小鼠于分組后第2天，雌鼠開始給藥，直至妊娠結束。

1.3 觀察指標 觀察小鼠給藥后狀態，對孕鼠于妊娠第22天處死，檢查子宮內胚胎數及其發育狀況。記錄孕鼠體重，著床數、活胎數、死胎數、吸收胎數。測量仔鼠的體重、身長、尾長等。

1.4 統計學分析 應用Instat統計軟件，計量資料以表示，采用單因素方差分析，計數資料比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對孕鼠生殖能力影響 與空白對照組相比較，用的4組著床數差異無統計學意義(P＞0.05)。TPM低劑量組活胎率、吸收胎率和死胎率與空白對照組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。TPM高劑量組和TPM高劑量+FA組與空白對照組比較活胎率顯著降低、吸收胎率和死胎率明顯升高(P＜0.01)，TPM高劑量組與TPM高劑量+FA組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 藥物對孕鼠生殖能力的影響 n=20，只(%)

2.2 對胎鼠生長發育的影響 與空白對照組相比較，TPM低劑量組、TPM高劑量組與TPM高劑量+FA組胎鼠體重、身長、尾長均顯著降低，差異有統計學意義(P＜0.01)，TPM低劑量+FA組差異無統計學意義(P＞0.05)。TPM低劑量組與TPM低劑量+FA組相比較，胎鼠體重、身長、尾長差異均有統計學意義(P＜0.01)。見表2。

表2 藥物對胎鼠生長發育的影響n=20，±s

表2 藥物對胎鼠生長發育的影響n=20，±s

注:與空白對照組比較，*P ＜0.01;與TPM的劑量組比較，#P ＜0.01

組別 胎鼠體重(g) 胎鼠身長(cm) 胎鼠尾長(cm)空白對照組1.57 ±0.08 2.39 ±0.13 1.17 ±0.06 TPM 低劑量組 1.21 ±0.07* 2.01 ±0.15* 1.01 ±0.09*TPM 高劑量組 1.09 ±0.04* 1.87 ±0.28* 0.98 ±0.07*TPM 低劑量 +FA 組 1.48 ±0.09# 2.15 ±0.27# 1.10 ±0.05#TPM 高劑量 +FA 組 1.22 ±0.06* 2.05 ±0.17* 1.02 ±0.04*

2.3 對胎鼠畸形方面的影響 與空白對照組相比較，TPM高劑量組畸形數明顯升高(P＜0.01)，其余組差異無統計學意義(P＞0.05)。TPM高劑量組與TPM高劑量+FA組相比較畸形數差異有統計學意義(P＜0.01)，畸形類型主要表現為唇腭裂、小頭、脊膜膨出、短肢等。見表3。

表3 藥物對胎鼠畸形方面的影響 n=20

3 討論

通過本研究發現TPM高劑量對小鼠的生殖能力有明顯的毒性影響，補充FA并不能有效拮抗這種毒性作用。TPM低劑量對妊娠期小鼠的生殖毒性作用較小。有報道證實，幾乎所有的藥物大劑量應用均能影響胚胎的發育［8］。該結果進一步證實了藥物對生殖方面的毒性與劑量相關。TPM高、低劑量對胎鼠的生長發育均有影響，補充FA能有效干預低劑量TPM的影響，但對高劑量TPM無明顯干預作用。高劑量TPM致畸作用明顯，補充FA能有效的拮抗致畸作用。本實驗證實TPM對小鼠的生殖能力、生長發育及致畸性均有影響，高劑量尤其明顯，妊娠期及時補充FA能起到有效的干預作用。

全世界約有1 800萬癲癇女性［9］，癲癇育齡期女性在發作完全控制或控制較好的情況下，要求妊娠的意愿明顯增強，因此前瞻性地研究癲癇女性妊娠期用藥的安全性以及胎兒先天性畸形的情況就顯得尤為重要。目前認為，AEDs有多種致畸機制，而其導致FA代謝障礙是較明確的一種。妊娠期間服用AEDs導致母體及胎兒體內的 FA水平降低，干預胚胎的外胚層分化，使神經管畸形的發生率升高［10］。癲癇孕婦與正常孕婦比較生育低體重兒和早產兒的幾率明顯升高，這與本次實驗結果相符合。

TPM是一種新型、高效的抗癲癇藥物，1980年首次在實驗室中合成，6年后開始用于治療癲癇患者，1995年正式在英國上市，1999年獲準在我國上市使用［11］。它主要應用于單純部分發作、復雜部分性發作和全身強直陣攣性發作，尤其對Lennox-Gastaut綜合征和West綜合征具有較好療效。它具有阻斷鈉通道與GABA-A受體相通作用，也具有拮抗FA代謝的藥理作用。該藥能誘導胚胎甲酰四氫葉酸水平下降，從而引起胚胎細胞分裂異常，導致胚胎停止發育、宮內發育遲緩、流產、畸胎等異常妊娠情況［12］。

FA是由蝶啶、谷氨酸和對氨基苯甲酸組成的B族維生素，是細胞生長和分裂所必需的重要物質［13］。它參與體內一碳單位的轉移和代謝，對DNA和RNA的合成以及細胞增殖和組織分化具有重要意義［14］，在核酸、蛋白合成及氨基酸轉化過程中也起著重要作用。FA缺乏可引起胎兒神經管發育缺陷，影響胎兒發育［15］。人類自身不能合成 FA，必須依賴食物供給。FA廣泛存在于動、植物性食品中，以水果、蔬菜和肉中含量較高。FA易迅速氧化為不可利用的形式，因而在烹調過程中易被破壞［16］。成人FA日需要量為50～100 μg，而妊娠期女性為滿足胎兒生長發育每天需要量為400～500 μg［17］。妊娠期女性低血清 FA 濃度會對妊娠期女性及胎兒造成多種不良影響。我國從20世紀80年代末期開始，全國各地區推廣服用FA增補劑，已經有效地降低了神經管畸形的發生，使高發地區預防率達到85%，低發地區預防率達到40%［18］。

由于存在種間差異，同一致畸物在不同物種和同一物種的不同品系動物的代謝過程有一定差異，不同物種動物胚胎構造也不盡相同。因此，對小鼠的實驗研究結果不能說明對人體的等同作用，需要進一步的深入研究和人群流行病學調查。

1 陳灝珠主編.實用內科學.第12版.北京:人民衛生出版社，2006.2705.

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6 Arpino C，Brescianini S，Robert E，et al.Teratogenic effects of antiepileptic drugs:use of an international database on malfonnations and drug exposure(MADRE).Epilepsia，2000，41:1436-1443.

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13 毛康娜，李丹丹，周鈺.北京市海淀區孕產婦增補葉酸現狀分析.中國優生與遺傳雜志，2013，21:80-81.

14 霍曉溪，王心，尚麗新.葉酸對妊娠期鄰苯二甲酸二酯暴露致孕鼠及其胚胎損傷的防治作用.山東醫藥，2012，52:10-12.

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