磷酸肌酸鈉對(duì)離體大鼠肝臟ALT/LDH指標(biāo)的影響

苑曉燁 王淼 曹經(jīng)琳 曾強(qiáng) 竇劍

肝臟移植是治療終末期肝病的最為有效的方法。但移植術(shù)后相關(guān)并發(fā)癥一直以來(lái)困擾著移植醫(yī)生。有研究證實(shí)，移植術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生在一定程度上與肝移植供體保存期間組織缺血缺氧及移植后再灌注損傷密切相關(guān)［1－5］。目前低溫缺血保存仍是普遍使用的供肝保存方法，且?guī)缀醵疾捎肬W液保存。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在離體腎臟UW液中添加多種非灌注液中常規(guī)存在的藥物，可對(duì)器官的保存產(chǎn)生積極的影響，延長(zhǎng)保持時(shí)限，同時(shí)明顯改善移植后腎臟功能恢復(fù)［4］。磷酸肌酸(creatine phosphate，CP)是一種高能磷酸化合物，是體內(nèi)高能磷酸基的暫時(shí)貯存形式。通過(guò)肌酸激酶的作用，可以供給ADP磷酸基以維持正常的ATP水平。而ATP是任何細(xì)胞代謝過(guò)程中最主要的能量源。本研究應(yīng)用含不同濃度磷酸肌酸鈉的UW灌注液對(duì)離體大鼠肝臟灌注后進(jìn)行冷保存，檢測(cè)冷保存期間不同時(shí)間點(diǎn)離體大鼠肝臟ALT/LDH指標(biāo)變化，分析其意義并探索合適的磷酸肌酸鈉應(yīng)用劑量。

1 材料與方法

1.1 材料 選用Wister系雄性大鼠40只，隨機(jī)分為對(duì)照組(單純UW液灌注肝臟)10只;低劑量組(以UW液為基液加入磷酸肌酸鈉，濃度為1 g/100 ml灌注肝臟)10只;中劑量組(以UW液為基液加入磷酸肌酸鈉，濃度為2 g/100 ml灌注肝臟)10只;高劑量組(以UW液為基液加入磷酸肌酸鈉，濃度為3 g/100 ml灌注肝臟)10只。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法符合動(dòng)物倫理學(xué)要求。

1.2 試劑 UW液購(gòu)自百時(shí)美施貴寶公司，HCA液(離體腎保存用枸櫞酸鹽嘌呤溶液)購(gòu)自上海長(zhǎng)征醫(yī)院注射用磷酸肌酸鈉購(gòu)自海口奇力制藥有限公司，乳酸脫氫酶(LDH)測(cè)試盒及谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)測(cè)試盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所

1.3 方法 動(dòng)物模型制備:采用大鼠肝臟單純冷保存離體灌注模型，大鼠術(shù)前采用10%水合氯醛以0.3 ml/100 g經(jīng)腹腔麻醉，取腹部“十”字形切口進(jìn)入腹腔，分離腹主動(dòng)脈，經(jīng)腹主動(dòng)脈插管，灌注4℃HCA液20 ml，經(jīng)門(mén)靜脈插管，對(duì)照組灌注單純4℃UW液，實(shí)驗(yàn)組分別根據(jù)組別灌注以4℃含不同濃度磷酸肌酸鈉的UW液，行供肝原位低壓重力灌洗(灌洗量20 ml)，同時(shí)剪開(kāi)大鼠心臟建立流出道，灌注至肝臟顏色變淡呈均勻土黃色完整切取肝臟，實(shí)驗(yàn)組供肝置于與灌注肝臟所用的相同濃度含磷酸肌酸鈉的4℃的UW液中，對(duì)照組供肝為4℃單純UW液保存。指標(biāo)測(cè)定:取由肝下下腔靜脈留取的保存液樣本，經(jīng)最佳取樣摸索及標(biāo)準(zhǔn)曲線畫(huà)定后，采用比色法，應(yīng)用可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)定各樣本的吸光度值(OD值)，根據(jù)計(jì)算公式計(jì)算ALT及LDH活性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，計(jì)量資料之間比較采用單因素方差分析;Mann-Whitney U檢驗(yàn)比較兩樣本頻數(shù)資料，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ALT不同時(shí)間點(diǎn)4組含量 肝下下腔靜脈內(nèi)的保存液中ALT不同時(shí)間點(diǎn)4組含量，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組肝臟經(jīng)過(guò)12 h冷保存后肝下下腔靜脈內(nèi)的保存液中ALT含量均小于對(duì)照組(P＜0.05)，但高劑量組在經(jīng)過(guò)24 h冷保存后，保存液中ALT含量大于對(duì)照組及中劑量、低劑量組(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 4組不同時(shí)間點(diǎn)ALT含量比較n=，U/L，±s

表1 4組不同時(shí)間點(diǎn)ALT含量比較n=，U/L，±s

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0.05;與低劑量組比較，#P ＜0.05;與中劑量組比較，△P ＜0.05

組別0 h 6 h 12 h 18 h 24 h對(duì)照組 46.52 ±1.52 53.05 ±2.68 63.66 ±3.15 64.48 ±1.31 73.81 ± 2.01低劑量組 45.66 ±2.25 51.58 ±1.52 58.49 ±1.85* 64.89 ±3.57 71.25 ±2.29中劑量組 45.29 ±2.09 51.72 ±1.65 58.52 ±1.79* 65.47 ±2.23 71.65 ±1.78高劑量組 46.09 ±1.57 52.45 ±1.55 58.93 ±3.26* 66.18 ±4.38 75.65 ±5.06*#△

2.2 LDH不同時(shí)間點(diǎn)4組含量 肝下下腔靜脈內(nèi)的保存液中LDH不同時(shí)間點(diǎn)各組含量，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組肝臟經(jīng)過(guò)12 h冷保存后肝下下腔靜脈內(nèi)的保存液中LDH含量均小于對(duì)照組(P＜0.05)。余各組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表2。

表2 4組不同時(shí)間點(diǎn)LDH含量n=10，U/L，±s

表2 4組不同時(shí)間點(diǎn)LDH含量n=10，U/L，±s

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0.05

組別0 h 6 h 12 h 18 h 24 h對(duì)照組 1 640.59 ±102.44 1 916.30 ±93.56 2 272.07 ±102.58 2 548.53 ±107.59 2 809.29 ±99.17低劑量組 1 653.37 ±115.06 1 889.75 ±84.37 2 164.77 ±86.01* 2 458.22 ±147.13 2 735.09 ±95.86中劑量組 1 590.96 ±108.71 1 883.55 ±102.69 2 171.52 ±87.47* 2 433.56 ±131.21 2 767.16 ±164.61高劑量組 1 663.63 ±86.82 1 997.20 ±104.45 2 173.95 ±60.18*2 500.76 ±70.30 2 779.28 ±62.23

3 討論

肝移植術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)病因素較為復(fù)雜。研究證實(shí)，其與供肝保存期間組織缺血缺氧及移植后再灌注損傷密切相關(guān)［1－3］。缺血/再灌注損傷涉及許多復(fù)雜級(jí)聯(lián)反應(yīng)的病理生理過(guò)程。其中包括中性粒細(xì)胞、血小板、細(xì)胞因子、活性氧、活性氮、凝血系統(tǒng)以及谷胱甘肽還原酶等因素的激活。最終引起細(xì)胞損傷、死亡、組織壞死最終導(dǎo)致多器官功能不全。

CP是一種高能磷酸化合物，體內(nèi)高能磷酸基的暫時(shí)貯存形式，是人體重要的能量供應(yīng)源。CP可明顯改善微循環(huán)供血，為細(xì)胞的有氧氧化提供能量［5］。外源性CP能被機(jī)體組織迅速吸收，直接釋放高能磷酸鍵合成ATP，迅速補(bǔ)充機(jī)體能量，保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定細(xì)胞膜，增加缺氧組織對(duì)氧的利用，減輕缺氧組織的損傷［6］心臟外科中應(yīng)用外源性CP作為能量基質(zhì)加入心臟停搏液中灌注心肌，能使缺血心肌細(xì)胞內(nèi)能量得到補(bǔ)充，線粒體及細(xì)胞膜功能得到維護(hù)，避免無(wú)氧代謝的損害，從而加強(qiáng)心臟停搏液對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。

ALT及LDH是檢測(cè)肝功能的常用指標(biāo)，肝細(xì)胞壞死時(shí)ALT升高，其升高的程度與肝細(xì)胞受損的程度相一致，因此是目前最常用的肝功能指標(biāo)。LDH是廣泛存在的催化乳酸和丙酮酸相互轉(zhuǎn)換的一種糖酵解酶。LDH存在于機(jī)體所有組織細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，幾乎存在于所有組織中。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，肝下下腔靜脈內(nèi)的保存液中隨著冷保存時(shí)間延長(zhǎng)，各組ALT、LDH含量逐漸增加，在6～12 h期間，對(duì)照組較各實(shí)驗(yàn)組 ALT、LDH含量增加明顯，以12 h時(shí)間點(diǎn)差別最為明顯，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組肝臟經(jīng)過(guò)12 h冷保存后肝下下腔靜脈內(nèi)的保存液中ALT、LDH含量均小于對(duì)照組(P＜0.05)。分析其原因可能因?qū)嶒?yàn)組添加了磷酸肌酸鈉以提供冷保存期間的能量，增加內(nèi)源性超氧化物歧化酶活性，有效清除氧自由基，減低肝組織脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)有關(guān)。但在保存時(shí)間終點(diǎn)即24 h時(shí)，高劑量組中ALT含量明顯高于對(duì)照組以及其他實(shí)驗(yàn)組。高劑量組考慮該結(jié)果與藥物濃度過(guò)大，因此增加了長(zhǎng)時(shí)間冷保存的肝臟組織破壞有關(guān)。

在目前各移植中心，多種因素導(dǎo)致供肝無(wú)法短時(shí)間內(nèi)移植入受體。其中包括供體的運(yùn)輸時(shí)間、移植患者因某些因素未充分完成術(shù)前準(zhǔn)備、手術(shù)摘除病肝困難等。因此，延長(zhǎng)供肝保存時(shí)限，減少供肝組織缺血損傷，降低供肝血流開(kāi)放后的缺血再灌注損傷，成為亟待解決的問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)表明，磷酸肌酸鈉對(duì)離體肝臟冷保存有較好的保護(hù)作用，其保護(hù)移植肝臟的機(jī)制可能與減輕能量代謝障礙，降低氧自由基損傷兩個(gè)方面作用有關(guān)，從而減輕了肝細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，穩(wěn)定細(xì)胞膜，減輕再灌注時(shí)的肝臟損傷。尤其對(duì)于經(jīng)過(guò)12 h冷保存后的肝臟具有有效的保護(hù)作用，但無(wú)法延長(zhǎng)最終即24 h冷保存后肝臟的質(zhì)量。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果提示磷酸肌酸在供肝保存中可能有較好的應(yīng)用前景，但本研究尚處于動(dòng)物試驗(yàn)階段，將其應(yīng)用于臨床供肝的保存以及成人供肝灌注及保存液中磷酸肌酸鈉的用藥濃度還有待于進(jìn)一步研究。

1 Ploeg RJ，D＇Alessandro AM，Knechtle SJ，et al.Risk factors for primary dysfunction after liver transplantion-amultivariate analysis.Transplantation，1993，55:804-813.

2 Ramalho FS，F(xiàn)ernandez MI，Rosello CJ，et al.Hepatic microcirculatory failure.Acta Cir Bras，2006，21:48-53.

3 Franco GR，Mosbah IB，Serafin A，et al.New preservation strategies for preventing liver grafts against cold ischemia reperfusion injury.Gastroenterol Hepatol，2007，22:1120-1126.

4 McAnulty JF，RP Reid TW，Waller KR，et al.Successful six-day kidney preservation using trophic factor supplemented media and simple cold storage.Am J Transplant，2002，2:712-718.

5 Wakade C，Kham MM，Desevilla LM，et al.Tamoxifen neuroprotection in cerebral ischemia involves attenuation of kinase activation and superoxide production and potentiation of mitochondrial superoxide dismutase.Endocrinology，2008，149:367-379.

6 桂靜，陳瑩，李永鳳，等.磷酸肌酸鈉對(duì)缺氧幼鼠腦組織中鈣調(diào)蛋白一氧化氮水平的影響.鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)醫(yī)學(xué)版2012，47:63-66.