轉錄因子 Cdx1在大鼠胚胎肛門直腸發育過程中的時空表達

張濤 張勝逆 李靖華 楊季紅 商琰紅 王曉春 李鵬 游冀鵬 張愛民 程樹杰

肛門直腸畸形(ARM)是常見的小兒消化道畸形之一，嚴重影響患兒的生活質量［1－3］。ARM的預防和治療的關鍵在于明確該畸形的基因調控和胚胎發生機制，普遍研究認為ARM是一組受多因素影響的，涉及多個基因的復雜畸形。最近國外學者在大鼠胚胎發育研究中發現Cdx1在哺乳動物尾端發育中起到了重要的作用，尤其是對于后腸的發育特別關鍵［4］。采用人類全基因組表達譜芯片技術對比分析正常和ARM患者直腸末端組織基因表達譜系的變化，結果顯示有多個涉及Cdx1在高位ARM與正常人直腸末端組織中呈現差異表達［5］。據此我們推斷Cdx1可能在泄殖腔和直腸的發育中起重要作用，與ARM的發生相關。而在胚胎期肛門直腸發育中Cdx1的時空分布模式仍不明確，Cdx1在ARM的發生過程中如何發揮的作用仍未得到滿意的解釋。因此，本研究應用乙烯硫脲(ethylenethiourea，ETU)致畸的Wistar大鼠的ARM 動物模型，分析Cdx1蛋白和mRNA在正常及ARM大鼠胚胎肛門直腸的時空分布規律，探討Cdx1在大鼠胚胎肛門直腸發育過程中所發揮的作用;研究Cdx1/Tcf4與ARM胚胎發生機制的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 動物:體重250～300 g的Wistar大白鼠(購自中國醫科大學動物實驗中心并飼養，CMU-WR-102)，雌雄午夜合籠后次晨雌鼠陰道涂片，顯微鏡下見到精子即確認已交配，此日計妊娠第0天。ETU組:24只大鼠于妊娠第10天經胃管注入125 mg/kg的ETU。正常組:12只大鼠于妊娠第10天經胃管注入等量的0.9%氯化鈉溶液。2組孕鼠分別做以下處理:分別于妊娠第13～16天，18天，21天正常組各取2只，ETU組各取4只孕鼠行剖宮術，取出所有胎鼠。將30%第16天之前的整個胚胎和第16天以后的胚胎軀干的尾部置入4%多聚甲醛磷酸緩沖液中固定，常規脫水，石蠟包埋，進行矢狀面連續切片，厚4 μm。余下胎鼠置于液氮15～20 min后轉移至－80℃冰箱保存，以備顯微切割提取組織蛋白和mRNA。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化染色:胎鼠正中矢狀面連續切片，Cdx1免疫組化染色。連續動態對比觀察Cdx1在正常和畸形大鼠胚胎泄殖腔及肛門直腸發育過程中的表達。免疫組化染色具體步驟:一抗為1∶200山羊抗大鼠Cdx1抗體(Santa Cruz公司，美國)，4℃孵育12 h。二抗采用福州邁新公司S-P試劑盒，DAB顯色經蘇木素復染，脫水、透明后封片。Cdx1免疫組織化學染色見胞核呈棕黃色為陽性，該細胞為陽性細胞。每次染色均設陰性和陽性對照。采用 NIS－Elements Basic Research多媒體彩色病理圖像分析系統對 Cdxl表達進行定位觀察分析，每張切片分別觀察100倍、200倍及400倍視野圖像，來判定陽性細胞的分布區域及大體變化趨勢。

1.2.2 Western-blot檢測組織中的蛋白質表達量:①常規制備三組胎鼠冰凍切片，解剖顯微鏡下手工顯微切割方法準確切取泄殖腔標本。組織總蛋白提取:組織經破碎，組織勻漿低溫離心，應用南京凱基全蛋白提取試劑盒提取總蛋白。其含量按改良Lowry法測定，于－20℃凍存備測。②Western blot雜交:取總蛋白40 μl，經6%SDS－PAGE電泳后轉移至硝酸纖維膜(Invitrogen公司)上，5%牛血清白蛋白封閉抗原后，加入山羊抗大鼠Cdx1抗體(1∶200稀釋)和β-actin抗體(1∶5 000 稀釋，Sigma公司)，4℃孵育12 h。洗膜后，加堿性磷酸酶標記的兔抗山羊IgG(工作濃度1∶2 000，Santa Cruz公司)進行二抗雜交、顯色。結果采用GIS－2020凝膠圖象分析系統掃描分析結果，對蛋白質含量進行密度分析，以相對灰度值代表蛋白表達量。

1.2.3 RT-PCR方法:常規制備2組胎鼠冰凍切片，解剖顯微鏡下手工顯微切割方法準確切取泄殖腔標本。RT-PCR方法具體步驟:Trizol提取組織總RNA，計算RNA純度。逆轉錄合成 cDNA反應體積為20 μl，具體步驟參照逆轉錄試劑盒(TaKaRa公司)推薦方法。利用Primer5.0版軟件設計引物(上海 Invitrogen生物技術有限公司):F-5’-TGTGGTGAGCCTGTTGGA-3’;R-5’-CCCTCTGAATCTTGGGAAAT-3’(116bp)，擴增片斷長度116bp。內參照選用β-actin，擴增片斷長度690 bp。PCR擴增反應總體積為25 μl。反應條件:95℃預變性 2 min，94℃ 40 s，52.4℃ 40 s，72℃ 40 s，35個循環，72℃延伸 7 min。PCR 產物于3%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶染色，紫外燈下觀察，以Marker DL2000為分子量標準。用G:BOX SYNGENE凝膠分析系統分析擴增產物。

1.3 統計學分析 應用SPSS 13.0統計軟件，計量資料以表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大體觀察結果 正常組共產胎仔186只，未見畸形發生。ETU組共產胎仔212只，均為無尾或短尾，根據切片觀察后分為給藥無畸形組(n=65)和畸形組(n=139)。ARM在 ETU組中的發生率為65.7%(139/204)。胎齡第16～21天胎鼠中的無肛畸形均為直腸尿道瘺和泄殖腔畸形。

2.2 免疫組化結果

2.2.1 正常組:第13天時，大量的Cdx1陽性細胞分布于尿直腸隔、后腸和泄殖腔膜的上皮層，在泄殖腔膜的外層細胞內也可見一定量的陽性細胞分布(圖1A、a)。第13.5天時，陽性細胞集中分布于背側尿直腸隔和后腸的上皮。第14天時，陽性細胞主要出現在尿直腸隔與泄殖腔膜的接近融合區域，同時，直腸肛管末端與尾溝的組織內也可見大量的陽性細胞。并且，免疫反應的強度幾乎達到頂峰(圖2 A、a)。第15天，大量的陽性細胞聚集于尿直腸隔與泄殖腔膜的融合區域的上皮;免疫反應強的陽性細胞在菲薄的肛膜上也出現。第16天，肛膜破裂，肛門直腸與外界相通，Cdx1在直腸黏膜層表達。

2.2.2 肛門直腸畸形組:第13天，Cdx1表達于尿直腸隔和后腸上皮中，強度較弱，在泄殖腔膜上皮僅在外層細胞中見到零星的陽性細胞分布(圖1B、b)。第13.5天，極少量的陽性細胞在泄殖腔膜、尿直腸隔頂端以及后腸上皮。第14天，陽性細胞散在分布在瘺管和后腸的上皮中(圖2 B、b)。第15天，直腸尿道瘺清晰可見，Cdx1在瘺管和后腸上皮中表達極弱。第16天，陽性細胞散在出現在瘺管和直腸肛管上皮中。與正常組相比，給藥無畸形組在各胎齡均差異無統計學意義(P＞0.05)。

2.3 Western-blot檢測Cdx1的表達 Western蛋白印跡結果顯示，與正常組相比較，Cdx1的表達在ARM組中表現出相對的時間不均衡性。在肛門形成的關鍵時期即第14天、14.5天和15天，于正常組Cdx1的表達量達到頂峰而在ARM組表達量明顯下降(156.9±23.5 vs.102.7 ± 14.4(第 14 天)，165.5 ± 26.2 vs.104.5 ±14.6(第 14.5 天)，153.6 ± 19.4 vs.76.2 ±10.7(第15天)(P＜0.05);自第16天起，在正常組和ARM組均可見Cdx1的表達開始減弱。見表1。

表1 Cdx1蛋白的相對表達量在正常組及ARM組的比較情況±s

表1 Cdx1蛋白的相對表達量在正常組及ARM組的比較情況±s

組別13 d 13.5 d 14 d 14.5 d 15 d 16 d正常組 72.5 ±10.8 134.9 ±20.3 156.9 ±23.5 165.5 ±26.2153.6 ±19.4 105.3 ±10.4 ARM 組 56.3 ±7.8 72.5 ±10.1 102.7 ±14.4 104.5 ±14.6 76.2 ±10.7 69.5 ±7.8 P組0.032 0.018 0.017 0.024 0.032 0.019

2.4 RT-PCR結果 在正常組和畸形組大鼠胚胎中均能檢測出Cdx1 mRNA表達。在正常組胎齡第14～15天為表達高峰期。畸形組與正常組相比較，Cdx1 mRNA的表達在第13～16天明顯降低［0.52±0.08 vs.0.38 ± 0.04(第 14 天)，0.49 ± 0.06 vs.0.37 ±0.08(第15 天)］，差異有統計學意義(P＜0.05)。肛門與外界相通后，即從GD16后Cdx1 mRNA表達量逐漸降低，正常組和ARM組在胎齡第18天和20天比較無明顯差異(P＞0.05)。見表2。

表2 Cdx1 mRNA的相對表達量在正常組及ARM組的比較±s

表2 Cdx1 mRNA的相對表達量在正常組及ARM組的比較±s

組別13 d 13.5 d 14 d 14.5 d 15 d 16 d正常組 0.27 ±0.03 0.36 ±0.03 0.52 ±0.08 0.49 ±0.06 0.47 ±0.05 0.36 ±0.04 ARM 組 0.18 ±0.01 0.27 ±0.06 0.38 ±0.04 0.37 ±0.08 0.36 ±0.03 0.26 ±0.07 P值0.023 0.021 0.016 0.022 0.047 0.035

圖1 Cdx1在第13天正常組和ARM大鼠胚胎泄殖腔的表達(A、B×100;a、b ×400)A、a為正常組、B、b為 ARM組 H:后腸;URS:尿直腸隔;U:尿生殖竇;CL:泄殖腔;CM:泄殖腔膜;TG:尾腸;橙色箭頭:陽性細胞

圖2 Cdx1在14d正常組和ARM大鼠胚胎泄殖腔的表達(A＆B×100;a＆b×400)A＆a為正常組，B＆b為ARM組H:后腸;URS:尿直腸隔;U:尿道;CL:泄殖腔;CM:泄殖腔膜;F:瘺管

3 討論

ARM的預防和治療的關鍵在于明確該畸形的基因調控和胚胎發生機制。普遍研究認為，ARM的發生是遺傳因素和環境因素共同作用的結果。流行病學和動物實驗表明遺傳因素在其發病過程中發揮重要作用［6］，ARM是一組受多因素影響的，涉及多個基因的復雜畸形。目前國內外對該畸形的實驗研究多采用動物模型，應用ETU、維甲酸等致畸大鼠產生ARM，觀察其胚胎發生的病理改變和基因表達規律及模式。最近有學者在應用基因敲除制備ARM小鼠模型中發現Shh 信號通路［7－9］、Fgf10［8］、Bmp4［9］、EphB2［10］可能參與了ARM的發，但在錯綜復雜的調控網絡中，上述基因又不同程度的與Cdx1通過不同信號分子間的通路存在相互作用，觸發了調節細胞生長、遷移、分化及發育等多方面的復雜信號級聯反應。

在消化道形成過程中，眾多基因參與其中，其中大多數基因在發育過程中具有高度保守-同源盒基因［11］。同源異型框基因及相關蛋白以核轉錄調節因子的形式調節生物結構及細胞分化，在生物體的不斷演化過程中，決定著生物體正常結構并始終保持相對的保守性。Cdx1為果蠅同源異型盒基因(homeobox gene)的同源體，編碼轉錄因子，可控制胚胎細胞的發育和分化［12］。在小鼠胚胎的研究中發現，至 GD8.5，Cdx1 mRNA最初表達于發育中腸管的內胚層細胞中［13］，該基因大部分表達限定在消化道上皮，起始于十二指腸，遍布于小腸和大腸，可提供上皮細胞沿消化道前后軸的位置信息，且在直腸區域表達至最高峰［14］;對消化道上皮細胞的增殖與分化起調控作用。上述結果提示在胚胎肛門直腸發育過程中，Cdx1發揮了重要的作用。

在本研究中，我們采用免疫組化染色、Western blot和RT-PCR技術分析Cdx1在正常和畸形大鼠胚胎發育中的時空表達模式。本研究中顯示，在正常組，Cdx1的表達有著嚴格的時間依賴性規律，在GD14、GD14.5和 GD15，Cdx1的表達處于最高水平，一旦肛門形成與外界相通，其表達水平即開始逐步下降;然而在畸形組中Cdx1的表達水平較正常組明顯減低且缺乏動態變化。Cdx1在蛋白水平和mRNA水平統計分析，發現在肛門形成的關鍵時期，即胎齡第14天、14.5天和第15天時在正常組二者的表達達到最高水平，然而在同時期的ARM組表達顯著的降低，這不僅說明Cdx1在正常的肛門直腸發育中發揮重要作用，在ARM的形成過程中可能也起到了關鍵的作用。綜上，我們認為，胎齡第14天、14.5和15天是Cdx1在胚胎泄殖腔發育中的最佳轉錄時間，而在此關鍵時期特異性的Cdx1表達下調會干擾肛門直腸的正常發育，影響靶基因在此區域的轉錄和翻譯，可能使尿直腸隔尾端細胞增殖和遷移受阻，尿直腸隔和泄殖腔膜的融合障礙，產生ARM。因此我們推測，在肛門直腸的發育過程中，Cdx1不僅對正常的發育有調控作用，并且胚胎時期的Cdx1表達水平的減低可能與ARM的發生相關。

本研究通過免疫組織化學方法發現正常胎鼠和ETU致ARM胎鼠泄殖腔和直腸Cdx1的表達呈現出空間依賴性的特點:在正常組，Cdx1主要集中表達于尿直腸隔尖端上皮、后腸背側、泄殖腔膜融合區等和尿直腸隔與泄殖腔融合作用相關的區域。GD16時肛膜破裂，肛門直腸形成，Cdx1在直腸黏膜層表達。而在畸形組中，在上述區域中僅有零星的陽性細胞出現。據此我們推測肛門直腸發育過程中的形態的變化是依賴Cdx1精準的空間定位表達的。Cdx1在ARM胎鼠泄殖腔和直腸黏膜亦有表達，但表達強度較正常組明顯減低，從而影響了泄殖腔/后腸區域在特定時間內的細胞增殖、轉化和細胞凋亡，會干擾肛門直腸的正常發育，影響靶基因在此區域的轉錄和翻譯，可能使尿直腸隔尾端細胞增殖和遷移受阻，尿直腸隔和泄殖腔膜的融合障礙，產生ARM。

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