重度慢性乙型肝炎患者的病毒耐藥突變檢測

閻納新 霍建峰 蘆飛 杜婧 李鐵牛 趙召霞 戴二黑

慢性乙型肝炎是我國常見的慢性傳染病之一，其中慢性乙型肝炎患者中約1%發生重癥化，預后差。雖然乙型肝炎的抗病毒治療已取得長足進展，然而重癥乙型肝炎的發病率未顯著下降，究其原因可能與乙型肝炎病毒(HBV)基因型、HBV耐藥變異和HBV再活化以及合并感染等因素有關。本研究收集51例石家莊地區的重度慢性乙型肝炎患者，分析患者體內HBV的耐藥位點變異情況，旨在探討石家莊地區重度慢性乙型肝炎患者HBV耐藥突變的狀況，為重度慢性乙型肝炎的預防和治療提供科學依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 51例患者均為2012年1月至2013年12月在石家莊市第五醫院就診的重度慢性乙型肝炎患者，其中男40例，女11例;年齡22～66歲，平均年齡(44.7±11.6)歲。診斷標準依據中華醫學會傳染病與寄生蟲病學分會、肝病學分會修訂的《病毒性肝炎防治方案》［1］。其中HBeAg陽性35例，HBeAg陰性16例。在獲取患者知情同意后留取血清標本，保存于－70℃冰箱內待測。

1.2 儀器與試劑 主要儀器包括ABI 7300實時熒光定量PCR儀、CEQ8000測序儀以及美國雅培C8000全自動生化分析儀。主要試劑包括乙型肝炎病毒(HBV)基因型及耐藥突變核酸測序試劑盒(北京鑫諾美迪基因檢測技術有限公司提供)和血清HBV DNA熒光定量檢測試劑盒(中山大學達安基因股份有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 血清 ALT、AST、TBIL和 HBV 標志物的檢測:采用雅培C8000全自動生化分析儀檢測血清ALT、AST和TBIL。采用ELISA法檢測乙肝五項，試劑盒由上海科華生物工程股份有限公司提供。

1.3.2 血清HBV DNA檢測:血清HBV核酸提取采用煮沸裂解法，采用熒光定量 PCR技術檢測HBV DNA載量。

1.3.3 HBV基因型及耐藥突變核酸測序檢測:實驗方法及步驟參照北京鑫諾美迪基因檢測技術有限公司的HBV基因型及耐藥突變核酸測序檢測說明書，結果分析應用 BLAST和 DNAstar等軟件將測序結果與GenBank的標準序列比對，確定基因型和突變位點。

1.4 統計學分析 應用SPSS 13.0統計軟件，計量資料以±s表示，采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 重度慢性乙型肝炎患者HBV P區突變情況 51例重度慢性乙型肝炎患者中，26例未發生突變，25例存在HBV P區發生突變，突變率為49.0%。突變與未突變比率在HBeAg陽性組和陰性組之間無顯著差別(P＞0.05)。見表1。

表1 重度慢性乙型肝炎HBV P區突變情況 例(%)

2.2 重度慢性乙型肝炎HBV P區突變組與未突變組臨床資料比較 HBV P區突變組HBV DNA水平顯著高于未突變組，ALT、AST和TBIL在突變組也顯著升高。見表2。

表2 重度慢性乙型肝炎HBV P區突變組與未突變組臨床資料比較±s

表2 重度慢性乙型肝炎HBV P區突變組與未突變組臨床資料比較±s

HBV P區突變分組HBV DNA(log10拷貝/ml) ALT(U/L) AST(U/L) TBIL(μmol/L)突變組(n=25) 6.17 ±1.33 548.3 ±452.3 223.1 ±132.5 90.6 ±71.4未突變組(n=26) 5.12 ±1.54 273.5 ±199.3 171.5 ±70.1 79.9 ±52.4 t值1.576 3.196 2.001 1.523 P值0.045 0.006 0.021 0.042

2.3 重度慢性乙型肝炎患者HBV P區突變模式分析

對25例存在HBV P區基因突變患者進行突變模式分析，結果顯示居于前四位的突變模式的總和占所有突變的72%。突變模式主要為rtM204I/V/S單獨突變以及聯合rtL180M和/或其他突變位點、rtA181V/T單獨突變以及聯合rtN236T或rtM250V/L突變。見表3。

表3 重度慢性乙型肝炎HBV P區突變模式分析

3 討論

HBV耐藥類型分為基因型耐藥、病毒耐藥和臨床耐藥。基因型耐藥是指HBV基因組出現某些特定的基因突變;病毒耐藥是指在基因型耐藥的基礎上，HBV DNA上升出現一個log10以上的變化或者由陰性變為陽性;臨床耐藥是指在病毒耐藥的基礎上出現ALT顯著升高或者肝臟組織學損傷加重［2］。上述三者之間是依次發生的過程。慢性乙型肝炎患者體內HBV在藥物和自身免疫力的雙重壓力下，以及HBV聚合酶缺乏校正功能等原因，HBV極易出現基因突變。當突變位點位于核苷(酸)類似物作用部位時，即發生HBV核苷(酸)類似物的基因型耐藥，耐藥的HBV將會進一步突變，而這些突變位點多有助于突變的HBV復制能力的提高，于是發生病毒耐藥，當突變的HBV大量復制后，易激發機體強烈的免疫應答，進而發生臨床耐藥，導致病情加劇。本研究結果顯示在重度慢性乙型肝炎患者中，HBV P區突變組血清HBV DNA水平顯著高于未突變組，突變組患者ALT、AST和TBIL水平也顯著升高，說明HBV突變后導致病情加重。

有學者研究發現HBV核苷(酸)類似物耐藥相關的P區變異分為主要耐藥變異和次要耐藥變異或代償性耐藥變異［3］。本研究結果顯示在重型慢性乙型肝炎患者中居于前四位的突變模式之和占所有突變的72%(18/25)，突變模式主要為rtM204I/V/S單獨突變以及聯合rtL180M和(或)其他突變位點、rtA181V/T單獨突變以及聯合rtN236T或rtM250V/L突變，所占比例分別為60%(15/25)和24%(6/25)。rtM204I/V/S是與拉米夫定相關的主要耐藥變異位點，當rtM204I/V/S發生變異后，HBV對拉米夫定的敏感性下降;rtL180M是拉米夫定的次要耐藥變異，是對rtM204I/V/S變異造成復制能力下降的一種補償突變［4］，因而在 rtM204I/V/S突變的基礎上常伴發rtL180M突變，使突變的HBV復制能力增強。除此之外，rtV173L、rtV207I等也是拉米夫定耐藥變異的代償位點，常合并rtM204I/V/S和rtL180M突變，使HBV存在多位點耐藥。rtA181V/T和rtN236T是阿德福韋相關的主要耐藥變異，常發生在阿德福韋初治耐藥患者中［5，6］。本研究結果也顯示 rtA181V/T突變常見，與文獻報道結果一致。因此，本研究中重型慢性乙型肝炎患者HBV P區突變位點主要是針對拉米夫定和阿德福韋的主要耐藥位點，可能與兩種核苷(酸)類似物抗病毒藥物臨床應用廣泛及用藥時間有關。拉米夫定和阿德福韋易發生耐藥，隨治療時間延長，病毒耐藥突變的發生率逐年增高，服用拉米夫定第1、2、3、4年的突變率分別為 14%、38%、49% 和 66%［7，8］;阿德福韋酯治療 1、2、3年的耐藥率分別為 0、1.6% 和3.1%［9－11］。因此，重度慢性乙型肝炎患者服用拉米夫定及阿德福韋酯等進行抗病毒治療過程中，應密切觀察病情變化，實時監測HBV P區耐藥狀況，及時調整用藥，保障抗病毒療效，防治肝衰竭的發生。

1 中華醫學會傳染病與寄生蟲病學分會，肝病學分會.病毒性肝炎防治方案.中華內科雜志，2001，40:62-70.

2 Zoulim F.Antiviral therapy of chronic hepatitis.Antiviral Res，2006，1:206-215.

3 Lok AS，Zoulim F，Locarnini S，et al.Antiviral drug-resistant HBV:standardization of nomenclature and assays and recommendations for management.Hepatology，2007，46:254-265.

4 趙召霞，許怡，侯軍良，等.拉米夫定耐藥慢性乙型肝炎患者HBVP區基因突變模式與臨床特征.分子診斷與治療雜志，2010，2:367-370.

5 邵幼林，張鎖才，柳龍根，等.ADV初治耐藥與LAM耐藥者再耐藥時HBV-RT區的變異特征.世界華人消化雜志，2012，20:1879-1883.

6 趙召霞，梅志勤，戴二黑.阿德福韋酯耐藥的慢性乙型肝炎患者特征分析.河北醫藥，2012，34:1660-1661.

7 Lok AS，Lai CL，Leung N，et al.Long-term safety of lam ivudine treatment in patients with chronic hepatitis B.Gastr0enter0logy，2003，125:1714-1722.

8 姚光弼，崔振宇，姚集魯，等.國產拉米夫定治療2200例慢性乙型肝炎的Ⅳ 期臨床試驗.中華肝臟病雜志，2003，11:103-108.

9 姚光弼，王寶恩，崔振宇，等.拉米夫定治療慢性乙型肝炎三年療效觀察.中華內科雜志，2003，42:382-387.

10 曾民德，茅益民，姚光弼，等.阿德福韋酯治療HBeAg陽性的中國慢性乙型病毒性肝炎患者52周的多中心臨床研究.中華傳染病雜志，2005，23:387-394.

11 Hadziyannis SJ，Tassopoulos NC，Heathcote EJ，et a1.Long-term therapy with adefovir dipivoxil for H BeAg-negative chronic hepatitis B for up to 5 years.Gastr Oenterology，2006，131:1743-1751.