用石蠟切片檢測端粒酶RNA基因對診斷與鑒別子宮頸上皮內瘤變1級與2級的意義

何春年 徐明堂 荀文娟

由于HPV的傳播及診斷技術提高，子宮頸上皮內瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)的發病率有上升趨勢。CIN發展為宮頸癌是一個長期的過程，早期診斷和恰當的治療完全可能阻止其發展為宮頸癌，并徹底治愈。就婦科臨床治療而言，CIN 1級可隨訪觀察，而CIN 2級則需要錐切等手術治療，故正確診斷CIN 1級與CIN 2級對臨床治療的指導意義是顯而易見的。然而病理學診斷是形態學的方法，有時因人為因素的影響及病變不典型等因素很難將CIN 1級與CIN 2級準確地鑒別出來，因此一些病例導致治療過度或治療不足。迫切需要一種敏感、準確、穩定及可靠的方法或指標來輔助病理學診斷。有研究表明3號染色體長臂拷貝數增加尤其是TERC基因的拷貝數增加在細胞學上鑒別宮頸高度癌前病變與低度癌前病變的敏感性及特異性均在90%以上［1］，推斷檢測TERC基因的拷貝數增加有助于CIN 1級與CIN 2級的正確診斷。我們前期在組織切片上對子宮頸癌和CIN的TERC基因檢測的研究有相近的結論［2，3］。本研究在宮頸組織石蠟切片上，采用FISH技術檢測TERC基因，探討其在CIN 1級與CIN 2級組織中的拷貝數變化情況，分析其診斷分級、鑒別診斷的作用，預測惡性進展風險及其臨床病理的實用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取河北省人民醫院2011年8月至2012年8月間手術切除或活檢子宮頸標本150例，組織用中性緩沖甲醛液固定，石蠟包埋;得到137例有效樣本，進行FISH檢測。其中正常對照宮頸鱗狀上皮20例，取自因子宮平滑肌瘤或子宮腺肌癥而切除的標本，經光鏡下證實鱗狀上皮無異常者，年齡25～54歲，平均年齡42歲;CIN 1級46例，年齡23～60歲，平均年齡41.5歲;CIN 2級49例，年齡24～58歲，平均年齡41歲;CIN 1/CIN 2級22例，年齡25～56歲，平均年齡40歲。全部標本首先由高年資病理醫師分析篩選，分類。最后利用十人共覽顯微鏡對所有標本進行聯合復診，將分類最終統一的標本納入研究樣本。這樣復核的意義在于避免因主觀因素的影響而導致的分級不準確。

1.2 CIN 1級與CIN 2級病理學診斷標準 CIN 1級:鱗狀上皮棘細胞層下1/3區域細胞核異型，罕見核分裂象，上2/3區域輕度異型，有成熟現象。CIN 2級:鱗狀上皮棘細胞層的上層、下層細胞異型均明顯，核分裂象一般限于上皮下2/3區域以下，上皮上1/2有成熟現象［4］。CIN 1/CIN 2級:介于CIN 1級與CIN 2級之間有爭議的病變，病變較CIN 1級而言，細胞核異型性稍大，在上皮下1/3層核分裂可見，但其病變程度達不到CIN 2級;然而較CIN 2級而言，核異型性較小，病變在上皮分布狀況、核的異型性與有絲分裂活動較少，均比CIN 1級重些，并伴有炎細胞或出現挖空細胞與HPV感染相關的病變。

1.3 探針及FISH檢測方法

1.3.1 探針:hTERC/CSP3 DNA雙色熒光探針由北京金菩嘉醫療科技公司提供。hTERC DNA探針雜交到3號染色體長臂(q26.3)，熒光信號為橘紅色(Rhodamine);CSP3 DNA探針雜交到3號染色體著絲粒 (3p11.1～q11.1)，熒光信號為亮綠色 (FITC)。

1.3.2 石蠟切片預處理:切取4 μm厚的切片，置于65℃烤箱烤蠟(過夜);新鮮二甲苯脫蠟10 min×2，隨后100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、85%乙醇、70%乙醇中各2 min，復水后浸入去離子水中3 min;90℃的蒸餾水處理30 min;室溫下蒸餾水洗片5 min×2;置于0.4%胃蛋白酶溶液中，37℃孵育20 min;室溫下2×SSC液洗片5 min×2;置于室溫的10%中性緩沖甲醛液中固定5 min，于室溫下2×SSC液洗片5 min×2，依次置于70%乙醇、85%乙醇、100%乙醇中各2分鐘脫水，室溫自然干燥。

1.3.3 FISH 操作步驟(避光環境):探針液 (7 μl雜交緩沖液、1 μl去離子水和 2 μl探針)在(78 ±1)℃的水浴中變性5 min;探針液置于45℃的水浴鍋中;組織切片在(78±1)℃在70%甲酰胺液中變性5 min后，依次置于－20℃的70%乙醇、85%乙醇、100%乙醇中各2 min，梯度脫水后室溫自然干燥;于56℃烤片機上預熱切片片刻后將10 μl探針液滴于雜交區域，加蓋蓋玻片，密封置42℃濕盒中雜交過夜。次日玻片依次置于預熱46℃的50%甲酰胺洗液10 min×3、2×SSC溶液10 min、0.1%NP-40混合溶液中5 min洗滌;室溫70%乙醇漂洗3 min，避光自然干燥后加15 μl DAPI復染液復染，立即蓋上蓋玻片，10～20 min后熒光顯微鏡下觀察。

1.4 FISH檢測判讀方法與標準 依據FISH技術檢測宮頸細胞學 TERC 基因的方法［1，4，5］，參考 FISH 方法乳腺癌HER2檢測指南［5］等文獻及探針試劑盒說明，在暗室中用OLYMPUS B×51熒光顯微鏡，DAPI/FIFC/TexasRed三色濾光鏡激發，100×物鏡下觀察間期細胞，判斷 FISH信號;用 VideoTest公司提供的FISH分析軟件分析圖像，評估整個切片的CSP3和TERC基因雙色探針雜交情況。紅色、綠色信號互為對照，淋巴細胞、基質細胞、內皮細胞的雜交互為對照。組織細胞中≥75%的細胞核顯示出雙色信號，視為雜交成功;否則為雜交失敗［6］。細胞拷貝數的確定:選擇細胞核大小一致，胞核邊界完整、DAPI染色均一，細胞核無重疊、紅綠色信號清晰區，確定細胞內FISH信號數的最大值，超過10%～20%的細胞所出現的信號數作為細胞拷貝的指標，用這種方法，病變可分類為二倍體、四倍體和非整倍體(異倍體)，再于病變的其他區域計數100～200個細胞的TERC基因的拷貝數，以驗證拷貝數(倍體數)的判斷。

1.5 敏感度、特異度、準確度、陽性預測值、陰性預測值計算公式 敏感度=a/(a+c)×100%，特異度=d/(b+d)×100%，準確度=a+d/(a+b+c+d)×100%，陽性預測值為=a/(a+b)×100%，陰性預測值=d/(c+d)×100%。a:CIN 1級中拷貝數增加的例數，b:CIN 2級中拷貝數增加的例數，c:CIN 1級中拷貝數不增加的例數，d:CIN 2級中拷貝數不增加的例數。

1.6 統計學分析 應用SPSS 16.0統計軟件，計數資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FISH實驗結果 熒光顯微鏡鏡下觀察:組織輪廓清晰，細胞核被DAPI復染呈藍色，可見細胞核的面積差異較大;熒光信號隨機分布于核染色區內，細胞核邊界清楚，TERC基因探針雜交為橘紅色熒光信號;CSP3(3號染色體著絲粒)探針雜交為亮綠色熒光信號，熒光信號均清晰。正常子宮頸鱗狀上皮為二倍體細胞，未見TERC有異常雜交信號(出現信號數大于2)(圖1);CIN 1級中少部分病例出現TERC基因的異常雜交信號，主要位于中-底層(圖2);而CIN 2級中3倍體、4倍體、非整倍體及TERC基因的異常雜交信號明顯增多，出現在中-表層(圖3、4)。部分病例亦可見明顯的多體信號成片融合現象(圖5)。

圖1 正常子宮頸鱗狀上皮:信號清晰，細胞核 DAPI染藍色，TERC基因為橘紅色信號;CSP3為亮綠色信號(FISH×2 000)

圖3 在CIN 2級TERC基因擴增明顯:可見三倍體，四倍體及多倍體(FISH×2 000)

圖4 在CIN 2級TERC擴增的多倍體(FISH×2 000)

圖5 在CIN 1/CIN 2級TERC擴增陽性病例的三倍體，三倍體和多倍體(FISH×2 000)

2.2 TERC基因檢測在CIN 1～2級組織中拷貝數增加的情況 正常宮頸鱗狀上皮組中TERC基因無擴增，0(0/20)，CIN 1級中 TERC基因擴增的情況為15.2%(7/46)，CIN 2級中TERC基因擴增的情況為47%(23/49)，并且出現大量的三倍體、四倍體及非整倍體擴增，2組之間差異有統計學意義(P＜0.05)。CIN 1/CIN 2級組TERC基因擴增的情況為27.8%(5/22)。組間兩兩比較:正常宮頸鱗狀上皮與CIN 1級組組間比較差異無統計學意義(χ2=0.092，P＞0.05);正常宮頸鱗狀上皮與CIN 2級間比較差異有統計學意義(χ2=14.08，P＜0.05);CIN 1 級與 CIN2 級間比較差異有統計學意義(χ2=11.05，P＜0.05)。見表1、2。

表1 TERC基因在CIN1與CIN2病變中拷貝數增加的比率例(%)

表2 TERC基因擴增在CIN1與CIN2級組間兩兩比較例(%)

2.3 經公式計算其TERC基因擴增在鑒別CIN 1級病變與CIN 2級病變中敏感度為46.9%，特異度為84.7%，準確度為65.0%，陽性預測值為 76.6%，陰性預測值為60%。見表3。

表3 TERC基因擴增在CIN1 and CIN2級的特異性 例

3 討論

CIN是子宮頸癌的一組癌前病變，其發生發展是一個連續的過程。目前病理組織學診斷CIN尤其是CIN 1級或CIN 2級，有時難以做出明確診斷。但絕大多數的CIN 1級會轉歸正常，只有15%的病灶會繼續進展，最后甚至演變成浸潤癌［5，6］。而CIN 2級進展為浸潤癌的比率則大大增加，因此，如能早期發現CIN 2級和正確鑒別CIN 1級與CIN 2級，是早期防治子宮頸癌前病變的關鍵。

現代遺傳學及分子生物學研究表明，人類大多數腫瘤細胞表現為染色體不穩定性;TERC基因的上調可以維持端粒的長度，使腫瘤細胞能夠突破正常的增殖限度，逃避細胞凋亡，從而導致惡性腫瘤的發生［7－9］。宮頸癌是由CIN發展而來，除了高危型HPV感染和整合因素外［10］，基因的改變亦有重要作用。有研究發現CIN及宮頸癌中，常見3號染色體長臂的擴增，并且異常基因多位于3q26.1～3q28，并把3q的增加部位定位于 3q26的 TERC基因。2003年，Heselmeyer等［1］首次采用FISH技術檢測子宮頸細胞中TERC基因，發現極少正常及CIN 1級細胞中可檢測到TERC基因拷貝數增加，陽性率為7.14%，而在CIN2級細胞中TERC基因拷貝數增加陽性率為62.5%，并且在CIN 1級與CIN 2級間比較，二者有統計學意義。我們前期工作及本次研究在石蠟包埋組織切片上用 FISH 方法檢測 TERC 基因［2，3］，同樣發現TERC基因是參與宮頸癌發生、發展的重要基因，其拷貝數增加可能是宮頸癌變的早期分子事件。在正常子宮頸鱗狀上皮中TERC基因無拷貝數增加，在CIN 1級中僅有少量擴增(14.8%)，而CIN 2級中擴增明顯增多(67%)，并且出現三倍體、四倍體及多倍體，二者比較差異具有顯著的統計學意義。在鑒別與診斷CIN 1級與CIN 2級時有明顯的臨床實用價值。其特異度、陽性預測值及準確度均較高，對于CIN惡性進展具有預測價值。對于CIN 1與CIN 2級鑒別困難的病例，發現TERC基因擴增的將其診斷為CIN 2;而無TERC基因擴增的診斷為CIN 1級，找到了基因水平的依據。

婦科臨床上對CIN2級及以上病變采取錐切等手術治療，而對CIN 1級病變采取定期隨訪或電燒灼等保守治療。通過FISH技術檢測TERC基因，對有爭議的CIN 2級病例進行了更準確地診斷，以確保臨床正確、適度地治療，具有很大的實用意義。因此，TERC基因檢測能有效的彌補形態學診斷CIN 1級及CIN 2級病變的不足，尤其是對CIN 2級病變的確診與鑒別，有臨床實用意義及應用價值。

目前TERC基因檢測成本較高，尚達不到在CIN組織學切片上普遍應用的程度，對于明確診斷的病例，不需要做TERC基因的檢測，僅一部分診斷有困難的病例，尤其是CIN 1級與CIN 2級鑒別困難時，為指導臨床治療或預測風險，可檢測TERC基因輔助診斷與鑒別［11］。隨著FISH檢測TERC基因成本的降低，該技術將被廣泛普及。

1 Heselmeyer-Haddad K，Janz V，Castle PE，et al.Detection of genomic amplification of the human telomerase gene(TERC)in cytologic specimens as a genetic test for the Diagnosis of cervical dysplasia.Am J Pathol，2003，163:1405-1416.

2 袁艷龍，何春年，徐明堂，等.應用熒光原位雜交技術在組織標本中檢測宮頸上皮病變的端粒酶RNA基因擴增.中華病理學雜志，2011，40:182-186.

3 He C，Xu C，Xu M，et al.Genomic amplification of hTERC in paraffinembedded tissues of cervical intraepithelial neoplasia and invasive cancer.Int J Gynecol Pathol，2012，31:280-285.

4 中華醫學會主編.臨床診療指南病理學分冊.第1版.北京:人民衛生出版社，2009.1.

5 Hopman AHN，Theelen W，Hommelberg PPH，et al.Genomic integration of oncogenic HPV and gain of the human telomerase gene TERC at 3q26 are strongly associated events in the progression of uterine cervical dysp lasia to invasive cancer.J Pathol，2006，210:412.

6 Shingleton HM，Patrick RL，JohnstonWW，et al.The current status of the Papanicolaou smear CA.Cancer J Clin，1995，45:305.

7 Ju Z，Rudolph KL.Telomeres and telomerase in stem cells during aging and disease.Genome Oyn，2006，1:84-103.

8 Nowak T，Januszkiewicz D，Zawada M，et al.Amplification of hTERT and hTERC genes in leukemic cells with high expressionand activity of telomerase.Oncol Rep，2006，16:301-305.

9 Royle NJ，Mrndez-Berm6dez A，Gravani A，et al.The role of recom—bination in telomere length mainten ce.Biochem Soc Trans，2009，37:589-595.

10 徐明堂，何春年，許長田，等.宮頸鱗狀上皮病變中乳頭狀瘤病毒16/18存在狀態的研究.中華病理學雜志，2013，42:400-401.

11 He H，Xia HH，Wang JD，et al.nhibition of human telomerase reverse transcriptase by nonsteroidal anti-inflammatory drugs in colon arcinoma.Cancer，2006，106:1243-1249.