固態法發酵白酒中正丙醇產生的機理研究

柏永昊，熊小毛，繆禮鴻 *，陳文靜

（1.武漢輕工大學生物與制藥工程學院，湖北 武漢 430023；2.湖北白云邊酒業股份有限公司，湖北 松滋 434200）

中國傳統白酒以谷物為原料，采用大曲或小曲提供糖化力和發酵力，經過浸泡、蒸煮、堆積、發酵和蒸餾等工序制成。其制曲工藝多為敞開式人工制曲，堆積培菌后進入窖池，窖泥微生物參與到發酵過程中來，因而固態法發酵白酒是一個由多種微生物參與的復雜轉化過程[1]。研究白酒中的微量組分與微生物之間的關系已成為熱點[2]。高級醇作為白酒呈香呈味的物質之一，能襯托酯類的香氣，含量太低會導致口味淡薄，但含量太高會引起酒體辛辣苦澀，刺激神經，使人上頭易醉[3]，因此我國白酒行業對高級醇含量有著嚴格的限制。正丙醇是高級醇的重要組分之一，在不同香型白酒中差異較大，兼香型白酒行業標準對其含量要求為0.2～1.0g/mL[4]。

固態白酒發酵過程中高級醇的產生機理尚不清楚，因此目前國內的研究主要從改變工藝條件對其加以控制，如改變投糧量、加曲量、加糠量、接種溫度等[5-7]。國外學者針對高級醇產生的機理，從細菌、酵母菌等菌種角度展開了研究。JANSSEN P H[8]證實了一株厭氧梭菌（Anaerobic clostridium）能夠發酵蘇氨酸產生丙酸和正丙醇。CARRAN F M[9]發現在低氮水平下，一株葡萄酒酵母能產生更多高級醇。酵母菌的乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）活性與葡萄酒的高級醇產生量呈正相關[10]。而有關正丙醇的產生機理有2個推論：其一，蛋白質分解機理，即蛋白質分解為氨基酸，氨基酸被酵母菌或細菌利用，蘇氨酸脫胺基、脫羧基形成正丙醇；其二，糖的厭氧發酵機理，即氨基酸中間代謝產物α-酮丁酸脫羧、還原生成正丙醇[11]。受蛋白質分解機理的影響，國內白酒行業普遍懷疑正丙醇的產生與堆積料的耐高溫細菌有關。細菌是窖泥中的主要微生物，也被廣泛關注[12]。本課題組前期的研究已表明芽孢桿菌不是白酒中正丙醇產生的主要因子[13]，在此基礎上，本研究旨在進一步研究固態法發酵白酒中正丙醇產生的機理，為白酒釀造過程中正丙醇等高級醇產生量的調控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株來源

根霉（Rhizopus）2-1：分離自“白云邊”小曲曲粉；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）2-5M：分離自“白云邊”小曲出池酒醅。

1.1.2 樣品來源

“白云邊”大曲二輪入池酒醅、三輪出池上中下層酒醅及混合酒醅、“白云邊”小曲曲粉、高粱等均由白云邊酒業股份有限公司提供。

1.1.3 培養基

牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，水1 000mL，pH 7.2～7.4。

虎紅培養基：北京奧博星生物技術有限責任公司，取35g溶于1 000mL蒸餾水。

酵母浸出粉胨葡萄糖培養基（yeast peptone dextrose medium，YPD）培養基：葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母粉10g，水1 000mL。

1.1.4 試劑

葡萄糖、氯化鈉：天津市科密歐化學試劑有限公司。牛肉膏、酵母粉、蛋白胨：英國OXOID公司。

1.2 儀器與設備

ZGP-2050普通生化培養箱：上海智誠分析儀器制造有限公司；Nikon YS100顯微鏡：廣州頤騰貿易有限公司；7890A氣相色譜儀：美國安捷倫公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 酒醅中細菌、酵母菌活菌數的測定方法

稱取10g酒醅樣品，加入裝有90mL無菌水的三角瓶中，170r/min搖床15min后，采用稀釋平板法[14]分別涂布于牛肉膏蛋白胨平板及虎紅平板上，置于30℃生化培養箱中培養2d，計數，取單菌落劃線分離、鏡檢。

1.3.2 工廠酒醅取樣及蒸餾方法

分別取A、B兩個班組的“白云邊”大曲酒二輪入池酒醅、三輪出池酒醅（上、中、下層）樣品各50g用于酒精蒸餾。蒸餾液經過濾后用氣相色譜法測定正丙醇含量。

普通蒸餾操作：取50g酒醅，加入150mL蒸餾水，蒸餾取酒樣100mL。

取頭酒蒸餾操作：取50g酒醅，加入100mL蒸餾水，蒸餾酒樣只取前15mL。

1.3.3 實驗室同步裝瓶發酵方法

現場取工廠已堆積結束、即將入池的酒醅裝入750mL的玻璃菌種瓶中，裝滿后壓緊，用8層保鮮袋封口，置于生化培養箱28℃發酵30d，取出酒醅進行蒸餾，過濾后用氣相色譜法測定正丙醇含量。

1.3.4 實驗室模擬小曲白酒發酵方法

取600g高粱于60～70℃蒸餾水中浸泡24h后取出，放置于蒸鍋上層，用紗布墊好，下層加水燒開，蒸粱1h。之后用100℃沸水浸泡燜粱0.5h，復蒸高粱1h，攤晾高粱，使之冷卻至30℃。接種小曲曲粉（接種量0.5%）后混勻。39～41℃堆積30h左右。將堆積料裝入750mL的玻璃菌種瓶中，裝滿后壓緊，用8層保鮮袋封口，置于生化培養箱28℃培養。發酵6d，取出酒醅蒸餾（普通蒸餾操作，同上），過濾后用氣相色譜測定蒸餾液中正丙醇含量及酒精度。

1.3.5 實驗室模擬小曲酒固態純種發酵方法

基本方法同1.3.4，接種時用2%純種培養的種子液替代小曲曲粉。種子液培養方法：YPD平板活化根霉2-1和酵母菌2-5M，30℃培養36h后，轉接到YPD液態培養基中，170r/min搖床培養12h。

1.3.6 蒸餾液中正丙醇及酒精含量的測定方法

蒸餾液中酒精、正丙醇、乙酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯的含量測定均采用氣相色譜測定法[15]。

1.3.7 色譜條件

色譜柱：極性柱DB-WAXETR；載氣為高純氮氣；流速為25mL/min，分流比為20∶l，氫氣流速為30mL/min，空氣流速為400mL/min。起始柱溫為60℃，保持2min，然后以5℃/min程序升溫至80℃。檢測器溫度：200℃；進樣口溫度：200℃。

2 結果與分析

2.1 工廠大曲入池和出池酒醅微生物數量測定結果

圖1 大曲酒酒醅活菌數測定結果Fig.1 The count results of microorganism in Daqu fermented grains

由圖1可知，大曲三輪出池酒醅中的細菌和酵母菌與二輪入池相比均大大降低，少量存活下來的為具有一定耐酒精能力的菌株。三輪出池下層酒醅的細菌數和酵母總數均高于中層和上層酒醅菌數，可能是由于下層酒醅含水率相對較高，易于菌體生長。

2.2 工廠大曲酒醅與實驗室同步模擬發酵酒醅結果比較

表1 工廠A組大曲酒醅取樣蒸餾與實驗室同步模擬發酵酒醅結果比較Table 1 Comparison of fermented distilled grains between samples from group A and synchronize simulate fermentation in lab

如表1所示，對比“工廠二輪入池酒醅”與“工廠三輪出池酒醅”，前者正丙醇含量為0，即堆積后沒有正丙醇產生，而出池酒醅正丙醇含量為334.16mg/L，這表明正丙醇產生于入池發酵過程中，而不是在堆積過程中。與此相反，堆積后乙酸乙酯含量為312.1mg/L，遠高于出池酒醅中的含量10.92mg/L，表明乙酸乙酯主要累積于堆積過程中。對比“工廠三輪出池酒醅”與“實驗室同步三輪出池酒醅”，由于后者沒有窖泥微生物的參與，但正丙醇含量達820.80mg/L，甚至超過了前者的正丙醇含量334.16mg/L，這表明正丙醇的產生與窖泥微生物無關。其含量過高的原因，推測是由于實驗室發酵條件比工廠更穩定，優勢菌種更早建立，因此乙酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯的含量也有一定差異性。對比“實驗室同步三輪出池酒醅”和其“取頭酒”的數據，后者的正丙醇含量大幅增加，表明蒸餾酒樣品中正丙醇含量與蒸餾和收集方法直接相關。乙酸乙酯、丁酸乙酯和乳酸乙酯的含量也隨取頭酒操作而增加。

如表2所示，工廠B組三輪出池的中、下層酒醅正丙醇含量均高于上層，而圖1反映了中、下層酒醅中的酵母菌活菌數也高于上層，由此可以看出，隨著取樣深度的增加，大曲酒醅的正丙醇含量和酵母菌數量呈正相關。與此相反地，下層酒醅的乙酸乙酯、丁酸乙酯和乳酸乙酯的含量卻低于上、中層，表明下層酒醅的發酵條件和環境抑制了產酯微生物的代謝，不利于優質白酒的產出。B組的實驗室同步三輪出池酒醅正丙醇含量為4 808.86mg/L，同樣超過了工廠的三輪出池酒醅，與A組的結果一致。這也表明正丙醇的產生與窖泥微生物無關。但是實驗室過于穩定的發酵環境使參與發酵的微生物種類變少，酯類含量與工廠出池酒醅有差異。

表2 大曲B組工廠取樣蒸餾與實驗室同步裝瓶發酵酒醅結果（取頭酒）Table 2 Comparison of fermented distilled grains between samples from group B and synchronize bottle fermentation in lab(the first liquor)

2.3 模擬小曲發酵過程中正丙醇產生時間及微生物數量的變化

圖2 小曲酒模擬發酵過程中正丙醇與酒精度含量的變化Fig.2 The propanol content and alcohol content change during Xiaoqu simulated fermentation

如圖2所示，在實驗室模擬小曲發酵過程中，堆積結束時正丙醇的含量很低，與工廠堆積料的測定結果相一致，但堆積料在裝瓶發酵后的前24h，正丙醇含量激增，24h后增加速度趨于平緩，4d時正丙醇含量幾乎達到最大值，4d以后正丙醇含量增加十分緩慢。酒醅中酒精含量隨發酵時間延長逐步提高。

如圖3所示，裝瓶后酒醅中的細菌總活菌數在前24h內急劇下降，2～4d內趨于穩定，4～6d細菌總數進一步降低；而酵母菌總活菌數在前24h內顯著增加，2～4d內趨于穩定，4～6d又有明顯增加，其變化趨勢與細菌恰恰相反。由此可以看出，酵母菌數量和正丙醇含量在實驗室模擬小曲發酵過程中也是呈正相關的。因此可以推測固態法發酵白酒，無論是大曲酒還是小曲酒，正丙醇的含量與入池酒醅的酵母菌生態群落結構有關。

圖3 小曲酒模擬發酵過程中細菌總數和酵母總數的變化Fig.3 The total bacterial and yeast amount during Xiaoqu simulated fermentation

2.4 模擬小曲固態純種發酵結果

如圖4、圖5所示，以接種小曲曲粉為對照，在整個發酵過程中，實驗室純種（僅接種根霉2-1和釀酒酵母2-5M）模擬小曲發酵的酒精產量與正丙醇產量均與對照組相近。表明釀酒酵母2-5M是模擬小曲發酵過程中正丙醇的主要產生菌株。

圖4 釀酒酵母2-5M純種模擬小曲發酵中正丙醇含量隨時間變化圖Fig.4 The time-varying propanol content of Xiaoqu simulated fermentation by pure Saccharomyces cerevisiae 2-5M

圖5 釀酒酵母2-5M純種模擬小曲發酵中酒精度隨時間變化圖Fig.5 The time-varying alcoholic content of Xiaoqu simulated fermentation by pure Saccharomyces cerevisiae 2-5M

3 結論

結果表明，酒醅中的酵母菌數量與其正丙醇含量成正相關。以不含窖泥的實驗室同步模擬大曲酒醅發酵試驗結果表明，固態發酵白酒酒醅中正丙醇的產生不依賴于窖泥微生物的存在。取頭酒的實驗結果表明蒸餾酒樣品中正丙醇含量與蒸餾和收集方式直接相關。

實驗室小曲模擬發酵實驗結果表明，酒醅發酵過程中酵母菌總數與正丙醇含量成正相關，而與細菌總數成負相關。堆積料在裝瓶發酵后24h內正丙醇含量激增，4d時正丙醇含量達到最大值。采用僅含釀酒酵母和根霉的純種接種劑與含細菌的小曲曲粉進行對比發酵試驗表明，兩者發酵的酒精度和正丙醇含量均接近。表明酵母菌是白酒中正丙醇的主要產生菌。實驗室接種小曲曲粉及純種發酵結果均表明，酒醅的酒精度與正丙醇含量基本呈正相關。由此可以推斷，固態法發酵白酒中正丙醇主要是在酵母菌進行糖的厭氧發酵過程中作為酒精的副產物產生的，而不是細菌對蛋白質分解導致的。

為了控制正丙醇的含量，對于由多種微生物參與的固態法白酒發酵而言，可以首先篩選出入池發酵階段中的各種優勢酵母菌，通過純種發酵和混合發酵的辦法找出產正丙醇高的酵母菌種類。進而研究其代謝條件。在工廠實際生產中，可以采用改變發酵條件抑制此類酵母菌代謝，或是選擇產酯高而產正丙醇低的菌株制成強化曲添加到接種環節中，達到控制正丙醇含量、提升酯類香味物質的目的。本研究為提高優質白酒的人工控制水平提供了理論依據，對實際生產具有指導意義。

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