siRNA靶向抑制ATDC蛋白對胃癌細胞生物學行為的影響

蔡煒龍 汪偉民 潘杰 王雁 許洪寶 馬志紅

siRNA靶向抑制ATDC蛋白對胃癌細胞生物學行為的影響

蔡煒龍 汪偉民 潘杰 王雁 許洪寶 馬志紅

目的 通過比較ataxia-telangiectasia group D complementing gene（ATDC）在永生化胃黏膜細胞GES與胃癌細胞系MNK45、AGS中的表達差異，探討其對胃癌細胞生長、增殖及侵襲能力的影響。方法應用Western blot實驗檢測ATDC在胃癌細胞系MKN45、AGS及永生化胃黏膜細胞系GES表達差異，利用慢病毒攜帶的siRNA下調ATDC在MKN45細胞表達水平，采用MTT實驗檢測細胞生長能力、流式細胞術檢測細胞周期、平板克隆實驗檢測細胞克隆形成能力以及transwell實驗檢測細胞侵襲能力。結果ATDC在人胃癌細胞系MKN45與AGS細胞中的表達水平均明顯高于永生化胃黏膜細胞GES（均P＜0．05）；轉染siRNA慢病毒后，與Con-MKN45及MKN45比較，Si-MKN45細胞的表達水平明顯下降（P＜0．05）；下調ATDC表達后MKN45細胞的生長能力明顯受到抑制（P＜0．05），S期細胞明顯減少、增殖指數克隆形成率及侵襲能力均明顯降低（均P＜0．05）。結論慢病毒攜帶的siRNA下調ATDC表達后能夠抑制胃癌細胞MKN45的生長、增殖與侵襲能力，可為胃癌的基因治療提供新的靶點。

胃癌 ATDC RNA干擾 增殖

胃癌是消化系統最常見的惡性腫瘤之一，居腫瘤相關致死率第二位[1]。由于多數胃癌患者發現時多為中晚期，缺乏有效治療，預后較差，導致高病死率。因此尋找新的標記物及治療靶點對于提高胃癌患者治療效果尤為重要。筆者的前期研究發現，ataxia-telangiectasia group D complementing gene（ATDC）在胃癌組織過表達與其惡性進展密切相關[2]，其可能在胃癌惡性生物學行為中起著重要作用。ATDC又名TRIM29，定位于人類11q23，編碼588個氨基酸的蛋白，其在正常胰腺組織呈陰性表達，但在胰腺癌中高表達，促進胰腺癌惡性進展[3]。本研究通過比較ATDC在永生化胃黏膜細胞系GES及胃癌細胞系MKN45、AGS中的表達差異，并應用慢病毒攜帶的siRNA技術下調其在胃癌細胞系表達后，探討其對胃癌細胞腫瘤生物學行為的影響，為胃癌針對ATDC生物靶向治療奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料 人永生化胃黏膜細胞株GES及人胃癌細胞系MKN45、AGS由第四軍醫大學腫瘤生物學國家重點實驗室贈送。細胞培養條件為：10%F月S于1640培養液中37℃、5%CO2培養箱中培養，本研究所用細胞均取對數生長期細胞。

1.2 方法

1.2.1 細胞蛋白檢測 采用Western blot進行檢測。收集細胞于細胞裂解液處理并離心后取上清液，以考馬斯亮藍法進行蛋白定量。SDS-Page凝膠電泳，20V恒壓轉膜，10%脫脂奶粉室溫封閉1h后，分別孵育一抗ATDC（Abcam；1∶500）與β-actin（Sigma；1∶3 000），4℃過夜，復溫1h后，用T月S-T清洗3次，6min/次；室溫孵育羊抗鼠二抗（北京中杉公司；1∶2 000）1h，再次T月S-T清洗3次，ECL顯影，每個實驗重復3次。以β-actin為參照，Quantity one軟件對條帶灰度值進行分析，計算目的蛋白相對表達量。

1.2.2 慢病毒攜帶的siRNA構建與轉染 慢病毒攜帶ATDC siRNA構建參照參考文獻[4]所報道的方法進行，以不含有siRNA片段的慢病毒載體為對照病毒，兩種病毒均帶有綠色熒光蛋白GFP基因片段。轉染前1d將MKN45細胞以1×106/孔接種于6孔板，細胞融合度為70%時進行病毒轉染。去上清液后用1640培養基（不含F月S）清洗細胞1次后，每空加入2ml不含血清的1640培養基，每空加入各自病毒液5μl，混勻后培養6h，去上清液，加入含10%F月S繼續培養。48h后熒光顯微鏡觀察帶有綠色熒光細胞比例，并分別命名為Con-MKN45及Si-MKN45細胞。

1.2.3 MTT實驗 將Western blot驗證的ATDC顯著下調細胞與對照細胞按照1×104/孔接種于96孔板，從接種后第1、2、3、4、5、6、7天MTT法檢測540nm處吸光度值。每個時間點設3個復孔，根據吸光度平均值及標準差繪制曲線，比較各組細胞生長差異。

1.2.4 平板克隆實驗 取對數生長期細胞，分別以200個/孔密度接種于6孔板內，輕搖使其均勻分布，放置培養箱內培養12d后，P月S沖洗3次后多聚甲醛固定10min，姬姆薩染色20min后清水洗去染液后空氣中干燥。計數克隆數，并按照以下公式計算：克隆形成率=（克隆數/接種細胞數）×100%。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞周期 胰蛋白酶消化對數生長期細胞，離心（800r/min）后去上清液，P月S清洗2次后收集細胞，加入已預冷的70%乙醇4℃冰箱過夜，P月S清洗1次后，加入碘化丙啶染液、Triton X-100及RNaseA，4℃冰箱避光孵育30min上機檢測。重復3次，細胞增殖指數（PI）按照如下公式計算：PI=（S+G2）/（S+G2+G1）× 100%。

1.2.6 Transwell實驗 應用Transwell實驗檢測細胞的運動侵襲能力，采用8μl孔徑的24孔月orden小室（月D公司），加入Matrigel凝膠（月D公司）制成基底膜。將對數生長期細胞消化后按 1×105/孔加入200μl無血清的培養基中，下室加入300μl含10%的培養基于孵箱培養24h后，取出小室，棉簽輕擦上室細胞，P月S洗3次后4%多聚甲醛固定，0.1%結晶紫染色，200倍光鏡下隨即選取5個視野進行計數基底膜下室的細胞數。

1.3 統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件，計量資料均以表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析；率的比較采用χ2檢驗。

2 結果

2.1ATDC蛋白表達情況 ATDC在胃癌細胞系MKN45及AGS的相對表達量分別為 0.92±0.03、0.68±0.04，再永生化胃黏膜上皮細胞系GES的相對表達量為0.29± 0.03，差異均有統計學意義（均P＜0.05，見圖1）。轉染siRNA慢病毒后，收集Si-MKN45、Con-MKN45及未轉染細胞（MKN45）蛋白，檢測結果顯示，與Con-MKN45及MKN45比較，Si-MKN45細胞條帶明顯變窄，其相對表達量（0.74±0.05、0.73±0.03，0.12±0.03）的差異均有統計學意義（均P＜0.05，見圖2）。

圖1 ATDC在胃癌細胞系MKN45、AGS及永生化胃黏膜細胞EGS中的表達情況

圖2 慢病毒攜帶的siRNA顯著下調ATDC在胃癌細胞系MKN45中的表達情況

2.2 細胞生長情況 見圖3。

圖3 細胞生長情況

由圖3可見，各組細胞在轉染后第1～3天的生長速度差異無統計學意義（P＞0.05），從第4天起，Si-MKN45細胞生長速度明顯低于Con-MKN45及MKN45細胞，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。

2.3平板克隆結果 MKN45、Con-MKN45及Si-MKN45細胞克隆形成數分別為140.3±7.6、142±2.7、65.3±7.0，克隆形成率分別為35.1%、35.5%、16.6%。Con-MKN45及MKN45細胞克隆形成率均明顯高于Si-MKN45（均P＜0.05，見圖4）。

圖4 平板克隆結果

2.4 細胞周期及增殖情況 見圖5。

圖5 細胞周期及增殖情況（A為各期細胞數的比較，B為3種蛋白PI值的比較）

由圖5可見，MKN45及Con-MKN45的S期分別為45%、46%，均明顯高于Si-MKN45細胞的S期（20%），差異均有統計學意義（均P＜0.05）；MKN45及Con-MKN45的G1期分別為39%、37%，均明顯低于Si-MKN45細胞的G1期（63%），差異均有統計學意義（均P＜0.05）。MKN45及Con-MKN45細胞的PI分別為60、61，均明顯高于Si-MKN45細胞的PI（36），差異均有統計學意義（均P＜0.05）。

2.5 細胞侵襲遷移能力 慢病毒攜帶的siRNA轉染后的MKN45細胞侵襲遷移能力明顯降低（圖6A）；通過計數穿過人工基底膜的細胞數發現，ATDC下調后MKN45細胞穿過基底膜的細胞數為61±6.8，顯著低于MKN45（198.8±16.1）及 Con-MKN45（205.2±21.6），差異均有統計學意義（均P＜0.05，見圖6月）。

3 討論

ATDC又名TRIM29，屬于TRIM家族成員，具有包括RING、月1及月2等保守的結構域[5]。文獻報道，TRIM家族蛋白能夠促進細胞生長惡性增殖[6]。應用基因表達譜技術已發現 ATDC蛋白在膀胱癌[7]、子宮內膜癌[8]等多種腫瘤細胞中表達上調，近期的研究發現ATDC在胰腺癌組織及細胞系表達增強與其腫瘤生物學行為密切相關，其通過激活Wnt信號通路及穩定β-catenin來發揮促癌作用[3]。筆者的前期研究發現，ATDC在胃癌組織高表達與患者惡性進展密切相關[2]，與組織表達趨勢相一致。

目前，中晚期胃癌治療效果不佳，基因技術的出現給胃癌治療帶來新的思路。RNA干擾技術，利用具有同源性的雙鏈RNA，靶向性結合目的mRNA，使其降解而達到基因沉默效果[9]。本研究應用慢病毒攜帶ATDC siRNA表達載體，轉染至內源性ATDC高表達的胃癌細胞系MKN45中，western blot驗證其成功下調ATDC在MKN45細胞中表達水平，建立穩定細胞模型為研究其對胃癌惡性生物學行為研究奠定基礎。

圖6 細胞侵襲遷移能力（A為3種細胞transwell實驗遷移至下室情況，B為3種細胞遷移至下室細胞數的比較）

ATDC蛋白表達降低后細胞的生長能力明顯受到抑制，細胞S期明顯減少，而G1期明顯增多，細胞PI顯著降低，提示細胞出現G0/G1期阻滯，這一現象與ATDC能夠激活Wnt信號通路及穩定β-catenin生物學功能相一致[3]；也可能是因為ATDC能夠與p53結合，抑制p53活性，調節p53相關基因比如p21及NOXA等導致細胞增殖能力增強[10]。平板克隆實驗結果顯示，Si-MKN45細胞克隆形成率顯著降低，提示干擾ATDC后胃癌細胞的增殖潛能與對生存環境適應性降低。ATDC能夠影響Tip60蛋白細胞亞定位，降低其對p53乙酰化作用，導致細胞生長能力增強[11]，當ATDC蛋白被下調后這一生物學功能受到抑制，而導致細胞生長能力下降。另外，transwell實驗結果顯示，ATDC下調后胃癌細胞侵襲能力也明顯受到抑制，而侵襲能力是胃癌發生轉移過程中的重要因素，這一結果與Kosaka等[12]的研究結果相一致。由此可見，下調ATDC后胃癌細胞惡性生物學行為明顯受到抑制，但本實驗基于體外細胞模型基礎上，其體內效果及分子機制尚需進一步深入研究。

總之，ATDC表達水平下調后可顯著抑制胃癌細胞MKN45的生長、增殖及侵襲能力，針對ATDC基因RNA干擾靶向技術，有望成為抑制胃癌復發與轉移的重要靶點。本研究應用western blot技術檢測發現ATDC在胃癌細胞系MKN45及AGS中表達水平顯著高于人永生化胃黏膜細胞系GES，這些證據提示ATDC在胃癌發生、發展中起著重要作用，有望成為新的治療靶點。

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Effects of ATDC gene silencing by siRNA on proliferation and migration of gastric cancer cells

ObjectiveTo investigate the effect of ATDC gene silencing by siRNA on the proliferation and migration of gastric cancer cells．MethodsThe expression of ataxia-telangiectasia group D complementing(ATDC)was detected in immortalized gastric mucosal epithelium cell line GES and gastric cancer cell lines MKN45,AGS by Western blot．Lentivirus-mediated siRNA targeting ATDC was transfected into MKN45 cells,and western blot was performed to evaluate the inhibitory effect of siRNA on ATDC expression．The proliferation,cell cycle,growth potentiality and migration of MKN45 cells were evaluated by MTT, plate cloning formation test,flow cytometry and transwell assays,respectively．ResultsThe expression of ATDC was significantly higher in both MKN45 and AGS cells compared with GES cells．Lentivirus-mediated siRNA targeting ATDC markedly repressed the expression of ATDC in MKN45 cells．MTT and plate cloning formation assays showed that down-regulation of ATDC significantly inhibited the proliferation and growth of MKN45 cells(P＜0．05)．Flow cytometry showed that the number of cells transfected with ATDC siRNA had higher G1,lower S phase and lower proliferation index(PI)(P＜0．05)than those of controls．Transwell assays revealed that the migration of cells transfected with ATDC siRNA was significantly deceased compared with controls．ConclusionThe expression of ATDC is increased in gastric cancer cells,and silencing of ATDC significantly suppresses the proliferation and migration of gastric cancer cells,indicating that ATDC may be a novel target for gene therapy of gastric cancer．

Gastric cancer ATDC siRNA Proliferation

2013-06-03）

（本文編輯：歐陽卿）

313000 湖州市中心醫院外科（蔡煒龍、汪偉民、潘杰、王雁、許洪寶），中心實驗室（馬志紅）