MicroRNAs與葡萄糖穩態的研究進展

王曉晶，聶 敏，孫梅勵

(中國醫學科學院北京協和醫學院北京協和醫院內分泌科衛生部內分泌重點實驗室，北京100730)

微小RNA (microRNAs，miRNAs)是一類廣泛存在于真核生物中的內源性單鏈非編碼小分子RNA，長度約22 個核苷酸。通過與靶mRNA 特異序列互補結合，降解或抑制靶基因的翻譯，調控細胞的生長、增殖、分化、凋亡以及生物體發育等一系列生理活動。近來研究發現，miRNAs 在胰島β 細胞的發育、胰島素的合成、分泌以及作用等過程中發揮重要的調節作用，與血糖平衡調節有關的miRNA 陸續被發現，本綜述簡述近來發現的miRNA 在血糖穩態調節中的作用。

1 miRNA 概述

自1993年發現第一個miRNA 分子lin4 以來，到目前為止，在人類基因組中已鑒定出上千種miRNA，參與約30%蛋白編碼基因的調控。miRNA 編碼基因首先在細胞核內經RNA 聚合酶Ⅱ轉錄生成初級轉錄產物Pri-miRNAs。隨后，經核酸酶Drosha以及輔助因子DECR8 剪切生成Pre-miRNA，細胞轉運蛋白exportin5 將Pre-miRNA 從細胞核轉運至細胞質，在Dicer 核酸酶的作用下進一步加工為成熟單鏈RNA 分子，其選擇性地整合至RNA 誘導沉默復合體(RNA induced silencing complex，RICC)，通過與靶基因mRNA 3'UTR 區互補配對結合，誘導mRNA 降解或抑制其翻譯，進而調控基因的表達。最近研究顯示，miRNA 生物合成以及與靶基因識別過程更加復雜，需要多種蛋白質分子的調控［1］。

2 miRNA 與胰島素的合成和分泌

正常的胰島β 細胞功能及胰島素在糖穩態的維持中起關鍵作用。miRNA 作為新型的基因表達調控分子，調節相關基因的表達，維持血糖在正常水平。miRNA 的表達及作用異常導致β 細胞功能障礙，使胰島素的合成和分泌受阻。

miR-375 是第一個與糖代謝有關的miRNA。miR-375 抑制靶基因MTPN 的表達，在胞吐作用的終末階段抑制葡糖糖刺激的胰島素分泌;并能降低靶蛋白磷酸肌醇依賴蛋白激酶1(phosphoinositidedependent protein kinase 1，PDK1)的表達水平，影響胰島β 細胞磷脂酰肌醇3 激酶(phosphatidylinositd 3-kinase，PI3K)/PDK1/蛋白激酶B (protein kinase B，PKB)信號通路傳導。然而，miR-375 不僅調控胰島素分泌，而且影響β 細胞增殖。敲除小鼠miR-375 基因可觀察到胰島β 細胞數減少，胰島α 細胞數增加，出現高血糖［2］。在沒有任何外源性輔助因子的作用下，過表達miR-375 能誘導人胚胎干細胞(human embryonic stem cells，hESCs)分化為類β 細胞樣胰島素生成細胞(insulin-producing β-like cells，IPCs)，且誘導生成的IPCs 細胞完全具備成熟β 細胞的特征:一方面，用葡糖糖刺激IPCs 細胞，可以檢測到胰島素的生成;另一方面，在IPCs 細胞中并沒有觀察到胰高血糖素或生長抑素與胰島素的共表達［3］。分析hESCs 向IPCs 分化過程中miRNA 表達譜的動態變化，發現miR-375 在IPCs 分化早期表達增加，隨后下降，相應miR-375 負調控的胰島胚胎發育中特異靶基因HNF1β 和SOX9 的表達呈現先下降后增加的變化，表明miR-375 以時空特異性的方式，促進胰島β 細胞的分化和成熟，但是該研究誘導生成的IPCs 并不具有上述成熟β 細胞特征，具體機制仍不清楚，推測可能與hESCs 細胞系以及誘導方式不同有關［4］。miRNA 如何誘導成熟胰島β 細胞生成并將其用于糖尿病的治療仍需進一步探索。

miR-124a 富集在胰腺組織，參與小鼠胰腺胚胎發育過程。miR-124a 過表達降低MIN6 細胞中轉錄因子Foxa2 及其下游內向整流鉀通道Kir6.2、磺脲受體1(sulphonylurea receptor 1，Sur1)的表達，而且抑制胰島素胞吐機制中分泌通路蛋白突觸小體相關蛋白 25 (synaptosomal -associated protein 25，SNAP25)、Ras 相關蛋白3A(Ras-related protein Rab-3A，Rab3A)和突觸蛋白-1A(synapsin-1A)的表達，促使基礎胰島素過度釋放而降低葡萄糖刺激的胰島素分泌［5］。此外，has-miR-124a 基因多態性位點rs531564 G 等位基因為羅馬人群2 型糖尿病高度易感等位基因(OR=2.15，P＜0.01)［6］。

miR-9 通過下調轉錄因子onecut 2 的表達，使胰島素胞吐機制的負調控因子granuphilin 的表達增加，葡糖糖刺激的胰島素分泌受到抑制［5］。向小鼠腹膜內注射葡萄糖后60 min，小鼠胰島β 細胞內miR-9 表達增加，相應的小鼠血清胰島素水平下降，進一步功能研究顯示，β 細胞增殖以及胰島素分泌過程中的關鍵分子去乙?；?(sirtuin-1，SIRT1)為miR-9 另一靶蛋白，miR-9 下調SIRT1 的表達，進而抑制葡萄糖刺激的胰島素分泌［7］。與miR-9 類似，miR-96 同樣上調granuphilin 蛋白的表達，但此作用獨立于轉錄因子onecut2，而是通過下調胰島素胞吐機制中必要因子Noc2 的表達，抑制胰島素的分泌［5］。

miR-29a、miR-187、miR-184 和miR-15a 也參與調控胰島素的合成和分泌。高糖環境下，胰島β 細胞中miR-29a 表達上調，直接抑制胰島素胞吐機制中突觸融合蛋白-1a (syntaxin-1a)的轉錄和翻譯，β細胞功能受損;抑制miR-29a 的表達則可以改善葡萄糖刺激的胰島素分泌［8］。miR-187 和miR-184 也與胰島素的分泌負相關，兩者分別抑制胰島素分泌的調控因子同源結構域作用蛋白激酶3(homeodomain-interacting protein kinase-3，HIPK3)和線粒體谷氨酸載體SLC25A22 的表達，降低葡萄糖刺激的胰島素分泌［9-10］。而miR-15a 通過抑制小鼠β 細胞產生內源性線粒體內膜超家族成員解偶聯蛋白-2(uncoupling protein-2，UCP-2)，促進胰島素的生物合成［11］。

3 miRNA 與胰島素抵抗

維持血糖的穩態不僅需要β 細胞的胰島素分泌功能正常，而且要求胰島素作用的靶組織，如肝臟、脂肪組織和骨骼肌等對胰島素反應敏感。盡管胰島素抵抗的具體機制尚不完全清楚，但越來越多的研究發現，miRNA 參與調節胰島素信號通路的傳導，與胰島素抵抗的發生有關。

3.1 miRNA 與肝臟胰島素抵抗

肝臟胰島素抵抗可表現為糖原合成和儲存減少，葡萄糖的輸出增加。酪氨酸蛋白磷酸酶(protein tyrosine phosphatase，PTP1B)是肝臟中表達最豐富的miR-122 的靶基因。PTP1B 蛋白能催化胰島素受體(insulin receptor，IR)和胰島素受體底物(insulin receptor substrate，IRS)去磷酸化，抑制肝臟內胰島素信號傳導;反義核苷酸抑制糖尿病小鼠體內PTP1B 蛋白表達，可以降低血糖和血胰島素的水平。而且PTP1B 活性下降，可以提高肥胖患者胰島素的敏感性。高脂飲食(high fat diet，HFD)喂養小鼠體內，c-Jun 氨基末端激酶1(Jun-N-terminal kinase 1，JNK1)表達增加，能抑制肝細胞核因子4α(hepatocyte nuclear factor 4α，HNF4α)磷酸化，使HNF4α與miR-122 基因結合受阻，miR-122 表達下降，增加的PTP1B 蛋白促使胰島素抵抗的發生，該病理過程可以被JNK1 抑制物逆轉［12］。

葡糖胺誘導的胰島素抵抗狀態HepG2 細胞中miR-181a 過表達，呈劑量依賴性的降低胰島素刺激的IR、PKB 和糖原合成酶激酶3β(glucogen synthase kinase 3β，GSK3β)的磷酸化。SIRT1 蛋白為miR-181a 作用靶點，HepG2 細胞過表達SIRT1 蛋白可以改善miR-181a 引起的胰島素抵抗，小鼠體內實驗得到了相同的結果，說明miR-181a 是調節肝臟胰島素敏感性的重要分子［13］。

miR-33a/b 抑制肝細胞IRS-2 表達，使胰島素信號通路下游蛋白PKB 活化受阻，抑制內源性miR-33a/b 表達則可以上調肝細胞對胰島素的敏感性，提示該miRNA 可能為代謝綜合征的潛在治療靶點［14］。HFD 喂養小鼠和db/db 小鼠肝臟中miR-143 表達增加，以下調氧化固醇結合蛋白相關蛋白8(oxysterol-binding-protein-related protein 8，ORP8)表達的方式抑制PKB 活化，降低胰島素敏感性［15］。類似于miR-143，肥胖能誘導肝臟miR-802 過表達，通過沉默靶基因(HNF1B)導致糖耐量異常以及胰島素抵抗，降低miR-802 的表達則可改善糖代謝異常［16］。

線粒體功能異常與胰島素抵抗和糖尿病的發病有關。miR-126 與miR-96 在線粒體功能異常的SKHep1 細胞中過表達，兩者均是通過下調IRS-1 蛋白表達誘導胰島素抵抗［17-18］。IRS-1 將胰島素信號從胰島素受體傳至細胞內的PI3K，是胰島素信號傳導通路上的關鍵分子，研究發現糖尿病模型小鼠以及糖尿病患者的肝臟中IRS-1 水平明顯降低，但具體的調控機制仍不清楚，與其相關的更多miRNA 分子有待于進一步被發現。

此外，多個研究用miRNA 芯片方法分析肥胖小鼠模型或糖尿病小鼠模型肝臟組織miRNA 差異表達譜，發現miR-103、miR-107、miR-125a 和miR-29a等表達明顯上調，通過作用于胰島素信號通路上不同環節的靶分子，參與胰島素抵抗。

3.2 miRNA 與脂肪組織胰島素抵抗

誘導脂肪生成和代謝的miRNA 表達異常與脂肪組織胰島素抵抗相關。首先發現miR-143 與脂肪形成有關，miR-143 在HFD 喂養小鼠腸系膜脂肪組織中表達增加，而且miR-143 的表達水平與小鼠體質量、腸系膜脂肪重量以及血清瘦素的水平呈正相關，絲裂原活化蛋白激酶7(mitogen-activated protein kinase 7，ERK5)水平輕度下降。但也有報道miR-143 在ob/ob 肥胖小鼠脂肪細胞的表達下調［5］。給出生1d 的小鼠腹腔內注射miR-143 鎖定核苷酸，沉默脂肪組織miR-143 的表達，并不改變小鼠脂肪細胞的大小、形態以及與脂肪形成有關基因的表達，而且miR-143 也不能抑制3T3-L1 細胞以及小鼠脂肪組織ERK5 的表達［19］。提示miR-143 可能通過多種途徑調節脂肪細胞的形成和功能，有待對miR-143 與脂肪細胞胰島素抵抗以及脂肪形成的相關性進一步探索。

過強的脂肪組織炎性反應是導致全身性胰島素抵抗的重要因素。miR-223 可通過抑制PKNOX1 的表達，調節巨噬細胞的極化，減弱脂肪組織炎性反應。HFD 喂養的miR-223 基因敲除小鼠血漿胰島素和血糖水平高于野生型小鼠，而且其脂肪組織中抗感染性M2 巨噬細胞浸潤減少，而炎性M1 巨噬細胞數增加。用特異的缺乏miR-223 的骨髓細胞進行小鼠骨髓移植，同樣出現嚴重的胰島素抵抗和糖耐量異常，同時脂肪組織中促炎細胞因子的表達也增加，進一步證實了miR-223 作為巨噬細胞極化的調節分子，有利于改善脂肪組織的炎性反應和全身性胰島素抵抗［20］。

miR-221 和miR-93 也涉及脂肪組織胰島素抵抗。腹部皮下脂肪組織中miR-221 的表達水平與BMI 和空腹血胰島素呈正相關，miR-221 通過下調脂聯素受體1(adiponectin receptor 1，ADIPOR1)的表達，干擾過氧化物酶體增殖體激活受體(peroxisome proliferator activated receptor，PPAR)信號通路的傳導，促進胰島素抵抗的發生［21］。miR-93 在多囊卵巢綜合征患者和存在胰島素抵抗婦女的脂肪組織中表達上調，通過下調葡萄糖運載體4(glucose transporter 4，GLUT-4)的表達降低胰島素敏感性［22］。

3.3 miRNA 與骨骼肌胰島素抵抗

骨骼肌是胰島素作用的另一重要靶組織，目前有關miRNA 與骨骼肌胰島素抵抗的研究相對較少。探討胰島素抵抗影響肌肉對負荷反應機制的研究發現，胰島素抵抗OZ 小鼠比目魚肌對負荷的肥大反應受損，與正常LZ 小鼠相比，OZ 小鼠比目魚肌中與肌肉生長發育有關的miR-133a 和miR-1 表達下降［23］。分析db/db 小鼠和正常小鼠腓腸肌miRNA表達譜的差異，發現miR-135a 在db/db 小鼠腓腸肌表達明顯上調，抑制了靶蛋白IRS-2 的表達、PI3K和PKB 的磷酸化以及胰島素刺激的葡糖糖吸收，沉默db/db 小鼠體內miR-135a 的表達，則可恢復。與正常人相比，miR-135a 在2 型DM 患者骨骼肌中的表達同樣上調［24］。

4 小結

miRNA 作為重要的基因表達調控分子涉及很多疾病的發病過程。近年來，越來越多的miRNA 被證實與胰島素的合成和分泌、胰島素抵抗以及糖尿病的發病密切相關。病理狀態下異常表達的miRNA，通過作用于胰島素分泌及胰島素信號傳導通路上的靶基因，影響血糖穩態的維持。表達異常miRNA 的發現，加深了對糖尿病發病機制的認識，也使得miRNA 作為2 型DM 生物標志物成為可能。然而，miRNA 調控網絡非常復雜，一個miRNA 可作用于多個靶基因，而一個靶基因受多種miRNA 的調控，同一種miRNA 又可在多種組織中表達，通過多種途徑參與糖穩態的調節。因此，miRNA 的靶基因及其功能仍需大量的研究進一步明確;另外，體外實驗到體內試驗的逐步深入，以及特定的miRNA-靶基因調節通路的確定也將為治療2 型DM 的藥物研發提供潛在的靶點。

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