電針對大鼠腎缺血再灌注損傷的療效及對腎組織中caspase-3表達的影響

白紅梅 張杰 陳璐

（南京中醫藥大學附屬醫院，江蘇南京 210029）

電針對大鼠腎缺血再灌注損傷的療效及對腎組織中caspase-3表達的影響

白紅梅 張杰 陳璐

（南京中醫藥大學附屬醫院，江蘇南京 210029）

目的：探討電針治療對腎缺血再灌注大鼠腎功能及組織中Caspase-3表達的影響。方法：將30只清潔級健康SD雄性大鼠隨機分為假手術組、缺血再灌注組（IRI組）和電針組，每組10只。采用右腎摘除，左腎腎蒂夾閉缺血45min后再灌注的方法制備動物模型。電針組于造模成功后給予電針腎俞和涌泉穴治療。各組均于術后24h采用全自動生化分析儀檢測血清尿素氮（BUN）和肌酐（Scr），觀察腎組織病理形態學改變，TUNEL法檢測腎組織細胞凋亡率和免疫組化檢測腎組織細胞中Caspase-3的表達。結果：腎缺血再灌注后大鼠血清BUN和Scr明顯升高，腎組織切片顯示有明顯的病理改變，腎組織細胞凋亡率及Caspase-3陽性細胞表達顯著升高。與缺血再灌注組比較，電針組大鼠BUN和Scr顯著下降，腎組織細胞凋亡率顯著降低，Caspase-3陽性細胞的IOD值顯著降低。結論：電針對IRI所致腎功能損害具有顯著的保護作用，能夠抑制Caspase-3蛋白表達，具有抑制細胞凋亡的作用，該作用可能是電針對IRI后腎臟保護作用的重要機制之一。

腎缺血再灌注損傷 電針 細胞凋亡 caspase-3表達 病理學 實驗研究

缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）是指缺血組織在重新獲得血供后，組織細胞損傷未見減輕反而加重的一種病理生理現象。研究表明，IRI可通過炎癥、活性氧、內皮素和細胞凋亡等多種途徑導致腎損害，而細胞凋亡是缺血再灌注致腎損傷的重要環節之一。因此，抑制細胞凋亡的發生，對IRI的防治具有重要的臨床意義。目前認為半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）依賴的細胞凋亡途徑在IRI誘導的腎小管上皮細胞凋亡中發揮主要作用[1]。近年有研究表明，電針治療可下調Caspase-3 mRNA及蛋白表達，進而可抑制細胞凋亡[2]。針刺耳穴可以減少血管癡呆大鼠海馬齒狀回Caspase-3表達，減少腦缺血缺氧所致的海馬齒狀回顆粒細胞死亡[3]。本研究旨在評價電針對缺血再灌注損傷腎臟的保護作用和對IRI誘導的腎組織細胞Caspase-3活性表達、細胞凋亡等的影響以探討電針對缺血再灌注損傷腎臟的保護機制及臨床應用的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗分組與模型制作將30只清潔級健康SD雄性大鼠（體重180～200g，江蘇省中醫院藥理實驗室提供）隨機分為假手術組、缺血再灌注組（IRI組）和電針組，每組10只。參照文獻[4]的方法建立腎缺血再灌注損傷模型，方法如下：采用3.5%水合氯醛1mL/100g腹腔麻醉后，腹橫切口入腹腔，切除右腎，顯露左腎蒂，用無創傷血管夾夾閉左腎蒂45min，造成腎缺血，然后松開血管夾行再灌注。松開血管夾，數分鐘內腎臟顏色由缺血時的暗紅色逐漸轉變為淡紅色，表示腎缺血再灌注模型建立成功。IRI組與電針組大鼠上法造模，假手術組做常規暴露左腎手術，不夾閉左腎蒂，45min后關腹。

1.2 電針治療方法參照第4版《實驗針灸學》大鼠標準穴位圖譜，選取腎俞和涌泉穴，常規消毒后，用直徑為0.22mm，長13mm的毫針，刺入3mm左右，接通華佗牌SD-I型電子針療儀，留針30min，采用連續波，頻率為3Hz，強度以大鼠尾巴輕微顫動為度。

1.3 檢測指標及檢測方法

1.3.1 血清尿素氮（BUN）和肌酐（Scr）各組大鼠術后24h經下腔靜脈取血2～3mL，檢測血清尿素氮（BUN）和肌酐（Scr）。

1.3.2 腎臟組織病理形態學觀察取左腎中間部位0.5cm× 1cm大小，固定，脫水，包埋，5μm厚度切片，HE染色，400倍光鏡下觀察腎組織病理形態的改變。

1.3.3 末端脫氧核苷酸轉移酶（TdT）介導的原位末端標記法（TUNEL）測定細胞凋亡率腎組織標本常規處理，切片，TUNEL染色，鏡下細胞核中有棕黃色顆粒者為陽性凋亡細胞。高倍鏡下觀察，對8個連續不重疊的視野中陽性細胞進行計數。細胞凋亡指數（AI）=（凋亡細胞數/腫瘤細胞總數）×100%。

1.3.4 免疫組化檢測Caspase-3的表達光學顯微鏡下觀察組織細胞中Caspase-3蛋白的表達情況，每張切片隨機采集5個高倍視野（400×），采用美國Media Cybernetics公司專業圖片分析軟件Image-Pro Plus，檢測Caspase-3表達的平均光密度值（IOD），所有視野均在同一光強度下檢測。

2 實驗結果

2.1 腎功能指標檢測結果與假手術組比較，IRI組和電針組大鼠BUN和Scr明顯升高（P＜0.01）；與IRI組比較，電針組大鼠BUN和肌酐Scr顯著下降（P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠血清中BUN和Scr含量（±s）

表1 各組大鼠血清中BUN和Scr含量（±s）

注：與假手術組比較，*P＜0.01；與IRI組比較，#P＜0.01。

組別動物數BUN（mmol/L）假手術組Scr（μmol/L）1011.14±2.5536.1±3.1 1032.30±3.62*電針組1022.18±3.02*#62.3±3.1*#IRI組109.4±8.6*

2.2 腎臟組織病理形態學觀察腎組織切片光鏡下顯示假手術組腎管細胞大致正常；IRI組大部分腎小管上皮細胞腫脹，出現不同程度的變性與壞死，間質有充血、水腫及炎性細胞浸潤；電針組腎小管病變減輕較為明顯，僅見部分腎小管上皮細胞輕度腫脹，少量變性與壞死，腎間質無明顯改變及炎細胞浸潤（見圖1）。

圖1 各組大鼠腎臟組織病理圖片（×400）

2.3 TUNEL檢測細胞凋亡率結果TUNEL陽性細胞表現為細胞核呈黃褐色，細胞質無染色，位于腎小管上皮細胞，腎小球無表達（見圖2）。圖像分析后，結果見表2。缺血再灌注損傷后，與假手術組比較，IRI組和電針組細胞凋亡率明顯升高（P＜0.01）；與IRI組比較，電針組大鼠腎組織細胞凋亡率顯著降低（P＜0.01）。

圖2 各組大鼠腎臟組織細胞凋亡情況（×400）

2.4 Caspase-3蛋白表達檢測結果Caspase-3陽性細胞表現為細胞質呈棕黃色，細胞核無著色，圖中細胞核呈深藍色系蘇木素復染的結果（見圖3）。圖像分析后，結果見表2。與假手術組比較，IRI組和電針組大鼠Caspase-3表達IOD值顯著升高（P＜0.01）；與IRI組比較，電針組大鼠Caspase-3表達IOD值顯著降低（P＜0.01）。

圖3 各組大鼠腎臟組織細胞Caspase-3表達圖（×400）

表2 各組大鼠腎臟組織細胞凋亡率和Caspase-3表達IOD值比較（±s）

表2 各組大鼠腎臟組織細胞凋亡率和Caspase-3表達IOD值比較（±s）

注：與假手術組比較，*P＜0.01；與IRI組比較，#P＜0.01。

組別動物數凋亡率（%）假手術組IOD 103.98±1.472001±606 1051.38±7.92*電針組1028.39±7.80*#3538±840*#IRI組7681±870*

3 討論

腎臟為高灌注器官，對缺血及缺血后再灌注均較敏感，因此在腎移植、腎血管手術、體外碎石、休克復蘇后很容易發生腎臟缺血再灌注，是缺血性急性腎衰竭（acute renal failure，ARF）的重要損傷環節，也是移植腎功能延遲恢復與慢性移植腎喪失功能的關鍵因素之一[5-6]。缺血如果能夠及時糾正，并且能夠盡可能避免或減少再灌注性損傷，腎功能可不受影響或很快恢復正常，但當腎臟局部缺血不能在機體自身神經體液等因素的調節下進行有益的平衡時，該缺血和隨后的再灌注損傷可導致不正常的信號轉導或細胞功能的異常，引發一系列凋亡事件和壞死。細胞凋亡是缺血再灌注組織和器官損傷的重要途徑[7]，而Caspase-3位于細胞凋亡的下游，是各種凋亡通路的必經之路，在細胞凋亡中發揮關鍵性作用[8]。

經絡學說研究人體經絡系統的循環分布、生理功能、病理變化及其與臟腑相互關系，是中國古代醫學家們在長期實踐中，經過對“針感”的傳導、俞穴療效的體表病理現象的推測與了解，生理知識總結而啟發創立出來的?！澳I俞”為腎的背俞穴，為腎臟氣輸注于背部的腧穴，具有補益腎氣的作用；“涌泉”穴為腎經的井穴，具有益腎、滋陰的作用。二穴在臨床上為治療腎臟及相關疾病的常用穴，具有較好的臨床療效。有研究表明，電針“腎俞”穴可升高腎血流量[9]。

本研究采用電針“腎俞”、“涌泉”兩穴治療缺血再灌注致腎損傷大鼠，結果表明經電針組大鼠血清BUN和Scr顯著下降，腎組織細胞凋亡率顯著降低，Caspase-3陽性細胞表達的IOD值顯著降低，提示電針對IRI所致腎功能損害具有顯著的保護作用，其深入機制有待進一步探討。

[1]Saikumar P，Venkatachalam MA.Role of apoptosis in hypoxic/ ischemic damage in the kidney. Semin Nephrol，2003，23（6）：511

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編輯：吳寧

R245.97

A

1672-397X（2014）01-0073-02

白紅梅（1965-），女，醫學士，主任醫師，麻醉學專業。1007gh@163.com

2013-04-08