和營安心方對胚胎心肌細胞氧化應激性損傷的影響*

賀 偉，李永民，張海霞，朱 娟，高 月

（河北北方學院,張家口 075029）

和營安心方對胚胎心肌細胞氧化應激性損傷的影響*

賀 偉，李永民，張海霞，朱 娟，高 月

（河北北方學院,張家口 075029）

[目的]研究和營安心方對過氧化氫（H2O2）所致大鼠胚胎心肌細胞氧化應激損傷的影響。[方法]用70%乙醇冷凝回流提取和營安心方，采用H2O2建立大鼠胚胎心肌細胞氧化應激損傷模型。實驗分為5組，分別為：正常對照組、H2O2（200 μmol/L）模型組、和營安心方高、中、低劑量組，其中和營安心方高、中、低劑量組分別加入和營安心方提取物500、250、125 mg/kg，24 h之后加入與模型組同濃度的H2O2（200 μmol/L），共同作用2 h。觀察心肌細胞四甲基偶氮唑鹽（MTT）代謝率、乳酸脫氫酶（LDH）含量、丙二醛（MDA）含量及各組細胞培養液中過氧化氫酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）的含量。[結果]H2O2組MTT代謝率顯著性降低（P＜0.01），LDH及MDA含量顯著性升高（P＜0.01），CAT及SOD含量顯著性降低（P＜0.05）；和營安心方可使H2O2損傷的心肌細胞MTT代謝率提高，MDA含量減少（P＜0.05），LDH活性降低（P＜0.05），并且顯著性提高心肌細胞的CAT和SOD含量（P＜0.05）。[結論]和營安心方對受損傷的心肌細胞具有明顯的保護作用，其機制可能與抑制氧化損傷有關。

和營安心方；過氧化氫；心肌細胞；氧化應激

和營安心方具有減輕慢性心力衰竭（心衰）大鼠心肌損傷、改善心功能、減緩心肌重構、減抑心肌細胞凋亡、改善神經內分泌和血流動力學的作用[1-3]。心肌細胞受外來因素的影響會發生氧化狀態的變化，心肌缺血時會產生大量自由基，造成氧化損傷[4-6]，但目前尚不清楚和營安心方對心肌細胞的保護作用是否與其抗氧化作用有關。本實驗用低濃度過氧化氫（H2O2）模擬心肌細胞氧化應激狀態，觀察和營安心方對H2O2致心肌細胞損傷的保護作用，并初步探討其中的機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1藥品與制備 和營安心方由桂枝75 g，西洋參100 g，茯苓75 g，玉竹75 g等組成，將和營安心方用70%乙醇，按照料液比為1∶7的比例進行提取，每次提取2 h，共提取3次，收集3次的提取液，將提取液濃縮為浸膏得到98 g，提取率為19.6%。

1.1.2實驗試劑 大鼠胚胎心肌細胞（H9C2），購于北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT），購于北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；DMEM-H液體培養基，購自美國Hyclone；新生胎牛血清，購自美國Gibco；0.25%胰蛋白酶溶液，購自美國Difco；3%（w/w）H2O2，購自美國Sigma；乳酸脫氫酶（LDH）、丙二醛（MDA）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD），均購自南京建成生物工程研究所。

1.2實驗儀器 旋轉蒸發儀，RE-52AA上海亞榮生化儀器廠；真空干燥箱，DZF-6050型寧波江南儀器廠；CO2細胞培養箱，Thermo；倒置熒光顯微鏡，Olympus。

1.3實驗方法

1.3.1大鼠胚胎心肌細胞的培養 大鼠胚胎心肌細胞（H9C2），細胞培養至80%～90%匯合時，加消化液（0.25%胰酶含0.03%EDTA）2 mL，預洗倒掉，再加1 mL消化液消化，顯微鏡下觀察至細胞完全脫離瓶壁分離成單個細胞后，加培養基混勻，1瓶分成3～4瓶，每瓶加培養基5 mL，37℃5%CO2孵育箱培養。

1.3.2實驗分組 消化后的細胞按每mL 5×105個的密度接種于48孔板內進行培養。分為以下幾組：1）正常對照組：正常培養的心肌細胞。2）氧化應激組：心肌細胞培養液中添加終濃度為200 μmol/L的H2O2作用2 h。3）和營安心方高、中、低劑量組：心肌細胞分別用高、中、低3種劑量濃度的和營安心方提取物（500、250、125 mg/kg）培養24 h后，添加終濃度200 μmol/L H2O2繼續作用2 h。最終收集心肌細胞及培養上清液用于實驗。

1.3.3MTT含量測定 將大鼠胚胎心肌細胞按照每mL 5×105個的密度接種于96孔板內，經不同濃度（和營安心方高、中、低劑量組：500、250、125mg/kg）藥物干預后，加入二甲基亞砜溶解細胞中的紫色結晶物formazan，用酶標儀在570 nm下測定吸光度，MTT結晶物形成的量與細胞數成正比，增殖生長旺盛的細胞將還原更多的MTT，并具有更高的吸光度值；反之則吸光度值越低。此方法用于細胞毒性實驗的測定。

1.3.4LDH、MDA、CAT、SOD含量測定 通過測定培養介質中LDH的含量評價H2O2對心肌細胞的毒性和膜損傷程度，測定采用2，4-二硝基苯肼顯色法。MDA是脂質過氧化反應的終產物，測定采用硫代巴比妥酸法。CAT及SOD的含量測定采用可見分光光度法，蛋白定量采用考馬斯亮藍法。

1.4統計分析 計量數據以均數±標準差（±s）表示，采用SPSS18.0統計軟件進行分析，組間比較用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1MTT代謝率測定結果 與正常對照組比較，H2O2模型組MTT代謝率明顯降低（P＜0.05），未經H2O2處理的和營安心方高、中、低各劑量組對MTT代謝率影響并不顯著。見圖1。

圖1 MTT代謝率

2.2培養介質中LDH、MDA、CAT、SOD含量的測定結果 結果見表1，H2O2處理使培養液中LDH相比于正常對照組含量顯著升高，和營安心方高劑量組及中劑量組能夠顯著降低H2O2所致的LDH含量升高，差異均有統計學意義（P＜0.01），但和營安心方低劑量組降低LDH的效果并不顯著。H2O2模型組使細胞培養液中MDA的含量顯著性升高，和營安心方高劑量及中劑量組能顯著降低培養液中MDA的含量（P＜0.01），低劑量組效果并不顯著。對于CAT測定結果，H2O2處理使培養液中CAT相比于正常對照組含量顯著降低，和營安心方高劑量組能夠顯著升高H2O2所致的CAT含量降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。H2O2模型組使細胞培養液中SOD的含量顯著性降低，和營安心方高劑量及中劑量組能顯著升高培養液中SOD的含量（P＜0.05），低劑量組效果并不顯著（每組5個副孔）。

表1 細胞培養液中LDH、MDA、CAT、SOD含量（±s）

表1 細胞培養液中LDH、MDA、CAT、SOD含量（±s）

注：與正常對照組比較，#P＜0.05,##P＜0.01;與H2O2模型組比較，*P＜0.05,**P＜0.01。

SOD (U/mgprot)正常對照組 5 13.69±0.20 10.04±1.56 11.34±1.15 30.11±2.43 H2O2模型組 5 19.12±0.22##19.64±1.15##5.84±1.22##21.88±0.96#和營安心方高劑量組 5 13.54±0.11**14.21±1.22**12.11±1.39*32.46±1.75**和營安心方中劑量組 5 15.86±0.07**12.14±1.07**8.38±0.66 35.87±3.48*和營安心方低劑量組 5 18.79±0.27 16.27±1.76 3.22±0.86 28.46±5.23組別 n LDH (U/L) MDA（nmol/L）CAT (U/mgprot)

3 討論

近年來活性氧自由基對心臟的損傷作用已引起人們的廣泛重視[7-9]。通常在組織的正常氧化代謝中會產生小量的自由基，同時通過細胞內的防御機制（自由基清除酶類和抗氧化劑）維持氧自由基的代謝平衡。但是在一些損傷因素的作用下，細胞內氧化代謝物增加或細胞中抗氧化保護機制不足時，使活性氧產生堆積并對細胞產生毒性。這種氧化和抗氧化的不平衡狀態稱之為氧化應激[10]。

心肌缺血誘導心肌細胞死亡，其機制并未完全闡明。有研究報道[11-12]，缺血的心肌組織中產生大量的自由基，活性氧自由基在缺血再灌注的心肌損傷病理發生過程中起重要的作用。H2O2是體內氧化代謝的中間產物，H2O2很容易穿透細胞膜到達胞內位點，如果H2O2的積累對心肌細胞產生細胞毒性，那將會帶來嚴重的后果。本研究采用低濃度（200 μmol/L）H2O2模擬缺血再灌注心肌細胞的氧化應激狀態，此濃度更接近于缺血再灌注時活性氧產生的濃度，所造成損傷的過程類似于體內活性氧導致心肌細胞損傷的病理過程[13-14]。

實驗結果說明，和營安心方可以抵抗H2O2對心肌細胞的損傷，維持心肌細胞膜穩定性和完整性。同時，和營安心方還可以顯著抑制由H2O2誘導的脂質過氧化，提示和營安心方對心肌細胞的保護作用與其抑制氧化損傷有關。

[1]李永民,王保和,賀 金,等.和營安心方對慢性心衰大鼠心功能及心肌細胞內鈣離子濃度的影響[J].中華中醫藥雜志,2009,23(4):536-538.

[2]李永民,王保和,趙 熒,等.和營安心方對慢性心衰大鼠心功能和心肌結構的影響[J].陜西中醫,2009,30(2): 227-228.

[3]李永民,王保和,邢立強,等.和營安心方對慢性心衰大鼠心肌細胞凋亡的影響[J].時珍國醫國藥,2009,20(2): 300-301.

[4]王 舒,韋 薇,李靈芝,等.蕨麻正丁醇部位對缺氧損傷心肌細胞的保護作用[J].天津中醫藥,2009,26(3): 250-252.

[5]易震南,梁 標,宋澤慶,等.黃芪減少砒石對大鼠氧化性損傷作用機制研究[J].天津中醫藥,2006,23(5):409.

[6] 吳 強,陳 吉.氧化應激與心肌細胞凋亡[J].中國心血管病研究雜志,2004,23(7):570-572.

[7] 賈錫蓮,曲竹秋,姚 凱,等.右歸丸減輕甲狀腺功能減退模型大鼠體內自由基過氧化損傷的機制探討[J].天津中醫藥,2008,25(3):225-228.

[8]姜希娟,范英昌,張紅霞.救心膠囊對LDL損傷內皮細胞抗氧化損傷能力影響的實驗研究[J].天津中醫藥, 2004,21(3):234-236.

[9]Ferrai R,Agnoletti L,Comini L,et al.Oxidative stress during myocardial ischaemia and heart failure[J].Eur Heart J,1998,19(Suppl B):2-11.

[10]楊 萍,賈鈺華.丹參酮Ⅱ-A抗心肌細胞氧化應激作用及抗增殖蛋白功能研究[J].中國實驗方劑學雜志,2011, 17(6):145-149.

[11]王 怡,王少峽,任 明,等.首烏丹參方預處理對缺血再灌注損傷大鼠心肌保護作用研究[J].天津中醫藥, 2006,23(5):413-416.

[12]孫 濤.山楂葉總黃酮對過氧化氫所致大鼠H9C2心肌細胞氧化應激損傷及誘導凋亡的保護作用[J].成都中醫藥大學學報,2011,34(1):86-91.

[13]楊 雷,郭青榜,盧 艷,等.槲皮素對過氧化氫所致體外心肌細胞損傷的保護作用[J].中國臨床康復,2006,28 (3):60-62.

[14]章海燕,龍明智,徐少華,等.姜黃素對乳鼠心肌細胞過氧化氫損傷的保護作用[J].江蘇醫藥,2008,34(4):374-376.

Effect of Heying Anxin prescription on oxidative stress injury in embryo myocardium of rats

HE Wei,LI Yong-min,ZHANG Hai-xia,ZHU Juan,GAO Yue
（Hebei North University,Zhangjiakou 075029,China）

[Objective]To investigate the effect of Heying Anxin prescription on embryo myocardium injury caused by H2O2.[Methods]Reflux condenser extraction with 70%ethanol of Heying Anxin prescription was used and the cardiomyocytes were incubated with H2O2(200 μmol/L)for 2 hours in model group.the same dose of H2O2was administered for 2 hours after treatment with Heying Anxin prescription(500 mg/kg,250 mg/kg,125 mg/kg)in therapeutic group and incubated for another 24 hours.Metabolic rate of MTT,content of MDA,activity of LDH and the levels of CAT and SOD in each group were measured.[Results]Metabolic rate of MTT:compared with control group,metabolic rates of MTT was decreased significantly in H2O2group(P＜0.01),while Heying Anxin prescription had no significant effect on cardiac myocytes of MTT metabolic rates.Content of MDA:compared with that of H2O2group,the content of MDA was decreased in Heying Anxin prescription groups significantly(P＜0.05).Content of LDH: compared with that of control group,the content of LDH was decreased in Heying Anxin prescription groups significantly(P＜0.05).Content of CAT:compared with that of H2O2group,the content of CAT was elevated in Heying Anxin prescription groups significantly(P＜0.05).Content of SOD:compared with that of H2O2group,the content of SOD was elevated in Heying Anxin prescription groups significantly(P＜0.01).[Conclusion]Heying Anxin prescription has significant protective effects on injured myocardium cell induced by H2O2in rats,and it may be related to the inhibition of oxidative damage.

Heying Anxin prescription;H2O2;myocardium cell;oxidative stress

R285.5

：A

：1673-9043（2014）04-0213-03

2014-03-14）

10.11656/j.issn.1673-9043.2014.04.07

河北省教育廳高等學校科學研究基金項目（2010215）。

賀 偉（1985-），女，碩士，助教，研究方向為中藥藥理學及中藥化學。

李永民，E-mail:liyongmin2001@sina.com。