水合氯醛合劑微生物限度檢查的驗證

杜建紅 張國慶 方晨 祝輝 劉徽

（成都軍區(qū)聯(lián)勤部藥品儀器檢驗所，四川成都 610017）

水合氯醛合劑微生物限度檢查的驗證

杜建紅 張國慶 方晨 祝輝 劉徽

（成都軍區(qū)聯(lián)勤部藥品儀器檢驗所，四川成都 610017）

目的：建立水合氯醛合劑的微生物限度檢查法。方法：按《中國藥典》（2010年版）二部附錄XI J“微生物限度檢查法”分別采用常規(guī)法、培養(yǎng)基稀釋法進行水合氯醛合劑的微生物限度檢查驗證試驗。結(jié)果：供試品對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的人工染菌回收率均高于70%，可用常規(guī)法進行細菌計數(shù)。對白色念珠菌和黑曲霉的人工染菌回收率高于70%，霉菌和酵母菌計數(shù)均可用培養(yǎng)基稀釋法。控制菌采用常規(guī)法驗證檢出陽性菌，陰性菌未檢出。結(jié)論：本品可采用常規(guī)法與培養(yǎng)基稀釋法結(jié)合進行水合氯醛合劑的微生物限度檢查。

水合氯醛合劑；微生物限度檢查；常規(guī)法；培養(yǎng)基稀釋法；驗證

水合氯醛合劑為《中國人民解放軍醫(yī)療機構(gòu)制劑規(guī)范》[1]（2002年版）所收載的內(nèi)服制劑，具有鎮(zhèn)靜、催眠和抗驚厥作用，用于精神緊張、煩躁不安引起的失眠及驚厥。《中國人民解放軍醫(yī)療機構(gòu)制劑規(guī)范》2002年版[1]未給出確切的微生物限度檢查方法，因此依據(jù)《中國藥典》（2010年版）二部[2]的附錄 XI J《微生物限度檢查法》中方法驗證試驗的要求，對本品建立微生物限度檢查方法并進行方法學驗證，確保方法的有效性。

1 儀器與材料

1.1 儀器

生物安全柜BSC-1000IIA2（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、潔凈工作臺SW-CJ-1FD（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、電熱恒溫培養(yǎng)箱DNP（上海精宏實驗設備有限公司）、集菌儀HTY601(杭州泰林生物技術(shù)設備有限公司）。

1.2 實驗樣品

水合氯醛合劑，成都軍區(qū)某醫(yī)院配制，批號：20130821、20130822、20130823。

1.3 菌種

大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]，均來源于成都市食品藥品檢測中心，均為第4代培養(yǎng)物。

1.4 培養(yǎng)基

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基、溴化十六烷基三甲胺瓊脂培養(yǎng)基，以上培養(yǎng)基均由北京三藥科技開發(fā)公司生產(chǎn)，按標簽說明進行配制。

1.5 稀釋液

0.9%無菌氯化鈉溶液、0.9%無菌氯化鈉溶液、pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液。

2 方法與結(jié)果

2.1 細菌數(shù)、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證

2.1.1 常規(guī)法測定細菌、霉菌及酵母菌數(shù)的方法驗證

2.1.1.1 菌液制備 取經(jīng)35℃培養(yǎng)24 h的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)物，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋至約含 50～ 100 cfu/mL的菌懸液，做活菌計數(shù)備用；取經(jīng)25℃培養(yǎng)24 h的白色念珠菌改良馬丁培養(yǎng)基培養(yǎng)物，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋至約含50～ 100 cfu/mL的菌懸液，做活菌計數(shù)備用；取經(jīng)25℃培養(yǎng)7 d的黑曲霉菌改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物，加 5 mL生理鹽水洗下孢子，吸出孢子懸液（用管口帶有薄紗布的無菌毛細吸管吸出孢子懸液）至無菌試管中，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋至約含50～100 cfu/mL的孢子懸液，做活菌計數(shù)備用。

2.1.1.2 供試液制備 取本品10 mL，加pH7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至 100 mL，混勻，即得1∶10供試液。

2.1.1.3 回收率測定 ①供試品對照組：取1∶10供試液1 mL，平行制備2個平板，測定供試品本底細菌數(shù)；取1∶10供試液 1 mL，平行制備 2個平板，測定供試品本底霉菌和酵母菌數(shù)。②菌液組：分別取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉5種試驗菌懸液1 mL，注入平皿，每株試驗菌平行制備2個平板，傾注瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置規(guī)定溫度培養(yǎng)，測定所加的試驗菌數(shù)。③試驗組：取1∶10供試液1 mL和大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌試驗菌懸液1 mL，分別注入平皿中，傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平板，待凝固后，35℃培養(yǎng)3天，計數(shù)；取1∶10供試液1 mL和白色念珠菌、黑曲霉菌懸液 1 mL，分別注入平皿中，傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平板，待凝固后，25℃培養(yǎng)7 d，計數(shù)。

結(jié)果見表1。

表1 常規(guī)法驗證細菌、霉菌及酵母菌試驗結(jié)果

采用常規(guī)法檢查，供試品對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的人工染菌回收率均高于70%，對白色念珠菌的人工染菌回收率高于70%，但對黑曲霉的人工染菌回收率低于70%。因此，本品細菌計數(shù)可采用常規(guī)法進行測定，霉菌及酵母菌的計數(shù)應重新選擇適當?shù)姆椒ǎ湟志钚院笤龠M行驗證。

2.1.2 培養(yǎng)基稀釋法（0.2 mL/皿）測定霉菌及酵母菌數(shù)的方法驗證

2.1.2.1 菌液制備和供試品制備 同常規(guī)法。

2.1.2.2 回收率測定 ①供試品對照組：采用培養(yǎng)基稀釋法測定供試品本底霉菌和酵母菌數(shù)。取1∶10供試液1 mL，等量分注至5個平皿（0.2 mL/皿），傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置25℃培養(yǎng) 5 d，測定供試品本底霉菌和酵母菌數(shù)。②菌液組：分別取上述白色念珠菌、黑曲霉 2種菌懸液1 mL，注入平皿，每株試驗菌平行制備2個平皿，傾注瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置規(guī)定溫度培養(yǎng)，測定所加的試驗菌數(shù)。③試驗組：分別取1∶10供試液0.4 mL，等量分注至2個平皿（0.2 mL/皿），每個平皿分別加入白色念珠菌、黑曲霉菌懸液1 mL，傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備 2個平板，待凝固后，25℃培養(yǎng) 7 d，計數(shù)。結(jié)果見表2。

表2 培養(yǎng)基稀釋法（0.2 mL/皿）測定霉菌和酵母菌數(shù)試驗結(jié)果

由表2可知，本品采用培養(yǎng)基稀釋法（0.2 mL/皿）檢查，供試品對白色念珠菌和黑曲霉的人工染菌回收率均高于70%，因此，本品霉菌和酵母菌計數(shù)可采用培養(yǎng)基稀釋法（0.2 mL/皿）進行測定。

2.2 控制菌檢查方法的驗證

2.2.1常規(guī)法檢查大腸埃希菌

2.2.1.1 供試液制備 取本品10 mL，加pH7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至 100 mL，混勻得1∶10供試液。

2.2.1.2 菌液制備 同2.1.1.1。

2.2.1.3 試驗組 取1∶10供試液10 mL及制備好的大腸埃希菌懸液1 mL加入到100 mL的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)24 h。吸取0.2 mL培養(yǎng)物接種至5 mL 4-甲基傘形酮葡糖苷酸（MUG）培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)，于 5，24 h在366 nm紫外線下觀察，同時用未接種的MUG培養(yǎng)基作本底對照。觀察后，沿培養(yǎng)管的管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液，觀察顏色變化。

2.2.1.4 陰性菌對照組 取 1∶10供試液10 mL及制備好的金黃色葡萄球菌懸液1 mL分別加入到100 mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基中35℃培養(yǎng)，其他操作同 2.2.1.3。

2.2.1.5 供試品對照組 取1∶10供試液10 mL加入到100 mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基中35℃培養(yǎng)，其他操作同2.2.1.3。

大腸埃希菌檢查方法驗證結(jié)果見表3。

表3 大腸埃希菌檢查方法（膽鹽乳糖培養(yǎng)基：100 mL）驗證結(jié)果

由表 3可知，陰性菌對照組加入金黃色葡萄球菌培養(yǎng)后，MUG和靛基質(zhì)均呈陰性反應，而試驗組檢出大腸埃希菌，本品大腸埃希菌可采用常規(guī)法（培養(yǎng)基：100 mL）進行檢查。

3 討論

本品可采用常規(guī)法進行細菌計數(shù)，培養(yǎng)基稀釋法進行霉菌和酵母菌計數(shù)，可采用常規(guī)法進行控制菌的檢查。根據(jù)驗證結(jié)果將微生物限度檢查方法記錄如下：取本品10 mL，加pH7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，混勻得1∶10供試液。細菌計數(shù)采用常規(guī)法，霉菌和酵母菌計數(shù)采用培養(yǎng)基稀釋法（0.2 mL/皿）進行檢查，控制菌采用常規(guī)法（培養(yǎng)基：100 mL）進行檢查《中國藥典》（2010年版）二部附錄Ⅺ J，應符合規(guī)定。本品為《中國人民解放軍醫(yī)療機構(gòu)制劑規(guī)范》2002年版所收載的內(nèi)服溶液劑，微生物限度檢查項可參照《中國藥典》（2010年版）中對口服溶液劑的標準檢查。

[1] 總后衛(wèi)生部.中國人民解放軍醫(yī)療機構(gòu)制劑規(guī)范 2002年版[S].北京：人民軍醫(yī)出版社,2002：附錄.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（2010年版）二部[S].北京：化學工業(yè)出版社，2010：附錄XI J.

Method Validation of Microbial Limit Test of Chloral Hydrate Mixture

Du Jianhong，Zhang Guoqing，F(xiàn)ang Chen，Zhu Hui，Liu Hui（Institute for Drug and Instrument Control of Chengdu Military Region，Sichuan Chengdu 610017，China）

Objective:To establish a method for the microbial limit test of chloral hydrate mixture.Methods:The microbial limit test on chloral hydrate mixture was validated by the routine method and membrane filtration method in accordance with the AppendixⅡof Chinese Pharmacopoeia （2010 edition）.Results:The recoveries of escherichia coli，staphylococcus aureus and bacillus subtilis by the medium dilution method were more than 70%，the routine method could be adopted for bacterial count.The recoveries of candida albicans and aspergillus niger were more than 70%，the membrane filtration method could be adopted for mould and yeast counts.The test organisms were detected in the control bacteria test by the routine method but no negative bacterial was detected.Conclusion:The routine method combined with medium dilution method can be applied for the microbial limit test of chloral hydrate mixture.

Chloral Hydrate Mixture；Microbial Limit Tests；Medium Dilution Method；Routine Method；Validation

10.3969/j.issn.1672-5433.2014.05.006

2013-12-26）

軍隊醫(yī)療機構(gòu)制劑標準提高科研專項課題面上項目（13ZJZ04-2）

杜建紅，男，副主任藥師。研究方向：藥物分析。通訊作者E-mail：yjsdjh@163.com