血管內皮生長因子在促進顱骨缺損修復中的實驗研究

韓金友　袁道英

【摘要】目的：探討血管內皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor ， VEGF）促進成骨缺損修復的機制。方法：雄性新西蘭大白兔 24只，體重1.5～2.0 kg。在兔顱骨兩側分別建立一個1cm×0.5cm全層骨缺損區，同時去除該區骨膜、保護硬腦膜。隨機選擇一側骨缺損作實驗側，植入復合PRP 的ABM；另一側為對照側，僅植入ABM。術后第2、4、8、12 周末分別處死兔6只取材。免疫組織化學法測定骨缺損修復區域血管內皮生長因子的表達； Image-proplus 5.0圖像分析軟件做VEGF表達強度的灰度測量。采用SSPS 16.0進行t檢驗統計學分析。結果：兩組相比，在第2、4周時差異均有顯著性（P <0.05），有統計學意義。結論：血管內皮生長因子在實驗組早期階段的強陽性表達，說明血管形成活躍。PRP促進骨修復的作用發生在植入后早期，啟動了早期活躍的成骨。

【關鍵詞】脫細胞骨基質；骨缺損修復；血管內皮生長因子；兔

【中圖分類號】R651.1 【文獻標識碼】B【文章編號】1004-4949（2014）03-0010-01

骨缺損的修復是骨組織再生的過程，其基礎則是傷口血管的形成和生長，血管的長入在組織修復中起著不可或缺的作用[1] 。修復過程中，在復雜的生物學調節機制作用下，各種各樣的細胞因子在不同的骨缺損愈合階段發揮各自不同的功能。其中，血管內皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor ， VEGF） 是最重要的促血管生成因子[2] ，在骨缺損愈合過程中發揮重要的作用。本文以兔為實驗對象，觀察VEGF在骨缺損修復過程中的表達、分布及其促進成骨的作用機制。

1材料與方法

1.1實驗動物及試劑

雄性新西蘭大白兔 24只（山東大學醫學院提供），質量1.5～2.0 kg。牛凝血酶（上海第一生化藥業有限公司）；10%枸椽酸鈉（濟南天和化工有限公司）；10%氯化鈣（濟南天和化工有限公司）；ABM（上海市組織工程重點實驗室）

1.2 兔顱骨缺損區制備

3%的戊巴比妥鈉按1mL/kg兔耳緣靜脈注射麻醉成功后，顱頂部備皮，手術區常規消毒鋪無菌巾單。耳前眶后正中部位切開皮膚及皮下組織，于骨膜上向兩側分離皮膚及皮下組織，中線處切開骨膜，向兩側游離至擬制備骨缺損范圍稍外處切除之。用牙科微動力牙鉆分別于顱正中縫左右兩側約0.5cm處各制備1.0cm×0.5cm的顱骨全層缺損，制備過程中以無菌生理鹽水降溫，并注意勿損傷硬腦膜，沖冼術區碎骨屑，無菌鹽水紗布覆蓋。

1.3 PRP制備、活化及與ABM復合

0.15g無菌ABM顆粒置于無菌托盤待用。按Marx等[3]所介紹的兩次離心方法制備PRP。耳中央動脈抽取全血5mL，注入預先放入0.3 mL枸椽酸鈉的無菌試管，2500r/min離心10min，取上清液至中間層以下1mm處移至另一無菌試管，再次以3000r/min離心10min，棄去上2/3，余下的1/3為約0.5mL PRP。10%無菌CaCl2溶液0.5mL溶解牛凝血酶50IU制備成PRP活化劑溶液，2mL注射器吸取該溶液0.3mL，PRP 0.5ml和1ml空氣，混勻后轉移至ABM顆粒處并與之充分混合。靜置1-2 min，混合物即成膠凍狀。可見ABM顆粒均勻分布于膠凍狀物質中，表示PRP活化并與ABM復合成功。

1.4 顱骨缺損修復及分組

隨機選擇一側骨缺損作實驗側，植入復合PRP 的ABM；另一側為對照側，僅植入ABM。逐層縫合切口。常規飲食， 術后3 d 每天40 萬U 青霉素肌注。分別于術后2，4，8，12周取材，暴露顱骨，去除骨缺損處粘連的軟組織，在骨缺損周圍0.5cm正常骨質處全層整塊取下顱頂骨，沖冼標本，去除表面血污，放入4%多聚甲醛固定液中，4℃條件下固定24h。然后常規免疫組織化學染色，陰性對照：用PBS代替一抗工作液，重復以上操作。

1.6 VEGF表達強度結果觀察

VEGF的陽性表達定位于胞質，呈淺黃色至棕黃色不等，隨著表達強度的增高顏色加深。陰性：細胞無著色，陽性：細胞染成淡黃色，強陽性：細胞染成棕黃色。表達細胞包括成骨細胞、成纖維細胞、破骨細胞，新生血管內皮細胞等。實驗組和對照組每側標本隨機選取6張VEGF免疫組織化學切片，在顯微鏡下取40倍視野，將圖像采集入Image-proplus 5.0病理圖像分析系統，每張切片觀察5個視野，觀察不同時間點兩組骨缺損區域VEGF的表達強度情況。隨機測10個陽性染色點灰度值，最后取平均灰度值，染色越深，灰度值越低。

1.7 實驗數據的統計學處理

各組VEGF表達強度平均灰度值結果的對比采用SPSS 16.0統計學軟件進行配對資料的t檢驗，結果用均數士標準差表示，以p <0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 VEGF在骨缺損修復中的表達強度灰度值

Image-proplus 5.0病理圖像分析系統測量兩組VEGF表達強度。結果顯示，隨著時間的延長，兩組的VEGF表達均呈逐漸降低的趨勢。但實驗組在2周至4周的時間區間內VEGF表達呈急劇下降，4周至8周至12周，下降趨于平緩。對照組在2周和4周時均呈強陽性表達。兩組VEGF表達強度在2周和4周的差異有顯著性（P <0.01） ，有統計學意義，而在8周和12周差異無顯著性（P >0.05）。

3討論

3.1兔顱骨骨缺損模型的建立

兔的頭皮層較薄，顱骨易于顯露，制備骨缺損手術操作相對簡單易行，術區結構簡單，相對安全。本實驗參照多位學者成功的研究結果建立了兔顱骨骨缺損的模型，此種類型兔顱骨骨缺損，如果不加入干預因素，如植入移植材料等，不能達到自然愈合，最后只能以軟組織瘢痕充填缺損區域[4，5] 。有了以上研究基礎，本實驗無需設計空白對照組。且本實驗采用動物自身對照的設計方案，避免了由于動物個體差異造成的偏倚，提高了不同干預方法之間進行結果比較的可靠性。

3.2 采用的骨移植材料

目前，學者們公認的認為理想的骨充填材料應具備以下條件 [6，7] ：（1） 無毒、不影響正常生長發育等良好的生物相容性；（2）有一定的機械強度和良好的可塑性，（3）能夠降解；（4）有一定的孔隙率。脫細胞骨基質（ABM）是對異體或異種動物的骨骼通過一系列生物化學方法處理，去除了基質中的細胞成分及間質大分子蛋白，而保留了骨組織的網架結構，其實質是骨脫細胞后的細胞外基質，是天然生物骨衍生材料的一種。其結構未發生變化，生物力學特性得以保留，具有天然的適合細胞、血管生長的三維網狀結構、合適的孔徑及孔隙率等[8]。

3.3 VEGF在修復骨缺損中的表達

傷口愈合和組織再生的基礎是血管的形成和生長 [9]。學者們研究表明，骨折修復過程中血管生成抑制可導致類似人類萎縮性骨不連的纖維組織形成[10]。血管內皮生長因子（VEGF） 是最活躍的血管生長因子， 它與血管內皮上的特異性受體結合， 在促內皮增殖和血管生成的過程中發揮著非常重要和強大的作用。Mayr-Wohlfart等[11]等在體外培養人成骨細胞的實驗中，用血管內皮細胞生長因子進行干預，結果成骨細胞的增殖能力提高了69%，這足以表明VEGF具有增強成骨細胞的分化增殖和成骨能力。還有學者通過研究發現[12]，在骨折愈合的不同階段不同的組織細胞VEGF的都有不同程度的陽性表達， 而VEGF在正常骨組織內則沒有表達。所以學者們一致認為，VEGF 在骨折修復過程中不同的表達程度體現了血供重建不同時期。實驗研究還表明，VEGF骨創傷修復過程中在早期的血管生成階段、后期骨痂結構形成、改建和礦化也有著高度活性表達 [12]。。因此，可以說VEGF 作為促使血管內皮細胞增殖、趨化的特異性細胞因子， 在骨修復過程中發揮著重要作用。

本實驗發現：在骨缺損修復愈合的不同階段， VEGF 基因的表達程度也是不同的。實驗組在第二周時表達細胞為成骨細胞、吞噬細胞、成纖維細胞、血管內皮細胞等，這些細胞VEGF的表達呈強陽性，與對照組相比具有顯著的差異性。然后，實驗組和對照組的VEGF表達均呈逐漸降低的趨勢。實驗組2周后的各種細胞VEGF表達強度呈明顯降低，并逐漸趨于平緩。作者認為其機理為：在實驗初期階段，實驗組PRP中含有大量的生長因子，成骨細胞、吞噬細胞、成纖維細胞、血管內皮細胞等表現VEGF的強陽性表達，具有迅速止血，減輕炎癥，促使血管的形成及骨修復作用；而對照組由于無復合PRP，其過程僅是由于骨缺損局部出血、炎性細胞反應、血流中斷等創傷因素因素引起VEGF的表達，表達強度比實驗組弱，并且會一直持續到術后第4周左右。根據各組組織學形態表現和VEGF的表達情況，可以認為PRP促進骨修復的作用發生在植入后7至14天內。實驗初期植入顆粒的嚴密包繞、形成大量的血管、伴以植入顆粒降解和炎癥迅速消退等原因，都是后期骨修復的基礎。

綜上所述，血管內皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor ， VEGF）促進骨缺損修復的機制為： 第一，提供多種高濃度的生長因子：PRP與ABM復合為骨缺損的早期修復提供高濃度的血小板源性生長因子（Platelet derived growth factor PDGF）、轉化生長因子-β（Transforming growth factor-β TGF-β）、VEGF、胰島素樣生長因子（Insulin-like growth factor IGF）等生長因子[13～15]。這些生長因子具有強大的促進成骨細胞增殖分化的能力。高濃度生長因子是機體內部自身修復系統的重要組成部分，所以它們能夠在植入骨缺損后迅速參與到機體的修復過程之中，有力地促進了骨組織的早期愈合。 第二，形成成骨性修復的局部微環境。在本實驗中，植入骨缺損ABM顆粒首先激活PRP，形成凝膠樣物質，促使血小板釋放生長因子。當這種凝膠狀物質復合ABM顆粒植入骨缺損處時，會使受植床中的細胞處于含有較多生長因子的微環境中。凝膠狀的形態具有的生長因子緩釋效應，使血小板短期釋放的生長因子能夠在較長時間內持續而穩定地釋放該處的微環境中。PRP復合ABM顆粒啟動了早期活躍的成骨活動，有利于骨缺損的早期愈合和后期的成骨效果。

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