高山離子芥CbCBF1基因耐鹽性功能的初步研究

賀泂杰

摘要[目的]研究高山離子芥CbCBF1基因的耐鹽性功能。[方法]將高山離子芥的愈傷組織在高鹽條件下進行時間梯度處理后，采用Real time PCR和Western blot分析CbCBF1在鹽脅迫下轉錄和翻譯水平表達量的變化。[結果]CbCBF1響應高鹽脅迫，并隨著處理時間的不同表達量呈現不同的變化趨勢。[結論]該方法考察了高山離子芥CbCBF1基因的耐鹽性功能，為高山離子芥CbCBF1基因的的進一步開發利用提供了依據。

關鍵詞CbCBF1；鹽脅迫；表達

中圖分類號S188文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）14-04175-01

The Preliminary Functional Research on the Salt Tolerance of CbCBF1

HE Jiongjie（Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Science of CAAS， Lanhzou， Gansu 730050）

Abstract[Objective] To study salt tolerance function of CbCBF1. [Method] Time gradient processing was taken on the callus of CbCBF1 in extreme condition of high salt. Then the change of transcription expression of CbCBF1 was analyzed under the salt stress by Real time PCR and Western blot. [Result] It was found that CbCBF1 response to salt stress， and the express of CbCBF1 present different trends under the different processing time. [Conclusion] The salt tolerance function of CbCBF1 was investigated， which will provide reference for further development and utilization of CbCBF1.

Key words CbCBF1； High salt stress； Expression

低溫誘導能夠產生轉錄因子CBF，CBF屬于DNA結合蛋白AP2/ERF家族，該家族成員均含有AP2 DNA結合域[1]。CBF誘導蛋白可以和下游COR基因啟動子中的CRT BOX相結合，誘導COR基因的表達，同時也能誘導一些生物合成酶基因的表達[2-4]。目前國內外研究發現，CBF調控的基因參與多種生理生化反應，如磷酸肌醇代謝和轉錄、活性氧清除物轉運、激素代謝和信號轉導，這些活動普遍發生在植物抗逆應答的過程中[5-6]。

高山離子芥是一種生活在天山冰川附近的植物，其生活環境海拔較高，氣候干燥、寒冷，具有較強的紫外線照射。雖然高山離子芥具有發達的通氣組織和厚壁組織，但其依然不具備典型的抗逆特征。因此其能夠在這一環境極端惡劣地區較好的生長和發育，一定與其體內特殊的分子信號傳導機制密不可分[7]。筆者對高山離子芥CbCBF1進行研究，以期在非模式植物中對CBF1轉錄因子進行深層次的認識，為后續研究該基因所介導的信號通路，利用基因工程技術綜合改良作物和園藝植物的抗逆性提供一種全新而有效的技術途徑。

1 材料與方法

1.1材料 載體和RNA提取試劑盒，由Tiangen公司生產；CbCBF1的cDNA全長序列，由實驗室通過抑制性消減雜交和RACE技術獲得；CbCBF1純化蛋白和兔抗，由實驗室提供。

1.2方法

浮組織總蛋白并測定總蛋白濃度。以離子芥懸浮組織的總蛋白作為內參。將不同時間梯度下的總蛋白依照一定上樣量做SDS-PAGE膠檢測；并借助生物學分析軟件image J對調整好的內參做灰度分析，求得相應灰度值。借助Western-blot技術分別研究不同處理組中離子懸浮組織CbCBF1蛋白的表達。曝光顯影后做灰度分析，得到CbCBF1蛋白表達水平的相關數據。

2結果與分析

2.1鹽處理對CbCBF1轉錄水平的調節性 實時熒光定量PCR的結果表明，鹽處理對于CbCBF1基因相對mRNA含量影響較大，1～6 h CbCBF1基因的相對mRNA含量處于不斷上升和降低的震蕩期，在鹽處理12 h以后CbCBF1基因的相對mRNA含量具有明顯的上調，在鹽處理48 h時，CbCBF1基因的相對mRNA含量上調倍數達到10倍以上，72 h卻有出現明顯的下降，說明離子芥CbCBF1基因對鹽脅迫較為敏感（圖1）。

圖1鹽脅迫處理下，離子芥CbCBF1基因相對mRNA含量的變化2.2鹽處理對CbCBF1翻譯水平的調節性 Western-blot技術結果顯示，CbCBF1蛋白的表達量在1～12 h均呈現出下降趨勢，但整體維持在一個相對穩定的水平下，24 h開始上升，在48 h時時表達量則上調至最高點，72 h稍有回落，但仍然維持在一個較高的水平，說明CbCBF1在（圖2）。

3結論與討論

試驗發現經過鹽處理后，CbCBF1基因在轉錄和翻譯水平的表達量均具有顯著的變化，說明CbCBF1參與高山離子芥耐鹽相關信號通路，響應鹽脅迫。鹽處理下，CbCBF1基因在前48 h內轉錄和翻譯水平上的表達趨勢相似，表明CbCBF1基因在響應鹽脅迫的信號通路中可能作為次級信號。高山離子芥懸浮組織在150 mmol/L NaCl鹽環境下隨著時間會逐漸發白，鹽處理72 h時提取的總蛋白濃度極低；而

圖2鹽脅迫處理下離子芥CbCBF1蛋白表達量變化趨勢及灰度分析圖CbCBF1蛋白的表達量卻依然在很高的水平。這說明CbCBF1基因可能參與細胞凋亡及組織壞死的信號調節網絡[8]。

安徽農業科學2014年參考文獻

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