平貝母愈傷組織的誘導及植株再生

孫雪等

摘 要：平貝母為一味傳統中藥，但其產量卻受繁殖系數低等因素限制。因而為篩選出平貝母鱗莖再生的最佳離體培養體系，本文分別研究了外植體種類，激素的不同濃度和組合以及光照對愈傷組織誘導的影響和不定芽再生的影響。

關鍵詞：平貝母 愈傷組織 不定芽

Callus Induction of Fritillaria ussuriensis and plant regeneration

SUN Xue XU Yuan Sun Chun yu Jiang Shi Cui Wang Kang Yu ZHANG Mei Ping WANG Yi

（Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China）

Abstract：Fritillaria ussuriensis is traditional Chinese medicine，but its production has limitations of low propagation coefficient.To filter out the best regeneration system of Fritillaria bulbs in vitro culture.This paper studies the kinds of explants，hormones has different concentrations and combinations，and light have effect on callus induction and bud regeneration.

Key words：Fritillaria ussuriensis Maxim；Callus；Adventitious buds.

平貝母（Fritillaria ussuriensis Maxim）為我國中醫學中常用的一味非常重要的藥用植物。其味甘補肺，入藥后能夠止咳化痰抗炎，是祖國傳統醫學中非常重要的一味中藥，因其良好的醫療效果，其市場需求量很大。但平貝母本身具有兩次生長兩次休眠的特性，因而生長緩慢，達到商業標準需要幾年的時間。平貝母多生長在高寒地帶，其繁殖系數低，田間管理費時費力，故而產量很低[1-2]。平貝母的快繁技術在提高其產量上起著非常重要的作用。目前在貝母屬植物中關于暗紫貝母、浙貝母、平貝母、伊貝母、和川貝母[3-7]的快繁技術均有報道。本文分別以平貝母的頂芽、莖段、葉片為外植體，再分別添加相應濃度的2，4-D、BA、KT、NAA獲得再生植株，又利用正交試驗的方式進而確定愈傷組織的誘導體系和植株的再生體系。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

實驗材料均取自吉林農業大學標本園種植的平貝母（2～4年生）3月中旬至4月中旬的頂芽、莖和葉片。

1.2 方法

1.2.1 外植體的處理：所有實驗材料均用用酒精（70%）進行消毒，時間為30s，消毒后用無菌水進行沖洗3～5次（1～2min/次），再用升汞（0.1%）消毒8～10min后，用無菌水沖洗3-5次，1～2min/次。葉片切成規格為0.4～0.5cm2的塊，莖、頂芽切成段規格為1cm的段。培養基為MS培養基，其成分為蔗糖3%，瓊脂0.65%。

1.2.2 平貝母最優培養體系的建立

將處理好的平貝母莖段、葉片、頂芽，分別接種到準備好的MS固體培養基中，定期觀察記錄生長狀況，并對愈傷組織及不定芽的誘導率進行統計。

植物生長調節物質對培養材料的影響：2，4-D、BA、NAA、KT四種生長調節物質進行不同濃度組合后，分別對培養材料進行處理，分析各物質對培養材料生長、分化的影響，以長勢和生物量的水平來確立最適濃度和種類。

光照對培養物的影響：取黑暗、弱光、強光等三個光照條件，觀察光對培養材料的影響。其中光強分別為1000Lx和2000Lx，光周期為16h/d。

1.2.3 試驗統計方法：平貝母愈傷組織誘導率=誘導愈傷組織數/接種外植體數×100%；平貝母不定芽誘導率=形成芽的塊數/外植體塊數×100%；平貝母不定芽分化率=分化綠點的愈傷組織塊數/接種愈傷組織塊數×100%；平貝母鱗莖誘導率=形成鱗莖的愈傷組織塊數/接種愈傷組織塊數×100%。

2 實驗結果

2.1 平貝母愈傷組織的誘導

2.1.1 外植體對平貝母愈傷組織誘導的影響

表1為不同外植體對平貝母愈傷組織的誘導效果，從表1中可以看出，平貝母不同種類外植體愈傷組織的誘導率差異較大。其中，誘導率最高的為莖段，達到77.5%，而葉片的誘導率為10%。

2.1.2 不同生長調節物質對愈傷組織誘導的影響

為了研究2，4-D、BA、KT和NAA四種生長調節物質的不同濃度配比后對愈傷組織誘導的影響，本文進行了L16（44）正交試驗。各種生長調節物質的因素和水平均如表2所示，實驗重復進行3次，每個實驗的樣本數大于30個。

表3為添加4種不同濃度激素后的正交實驗方差與實驗結果，從表中可知平貝母愈傷組織的誘導率因生長調節物質的濃度不同有差異，可以得出RA>RC>RD>RB，因而2，4-D是愈傷組織誘導過程中的主要影響因素。相比之下KT、NAA和BA對愈傷組織誘導率的影響較小。能夠使愈傷組織誘導率達到最高的激素組合為A3、B4、C3、D1，即2，4-D濃度為2.5mg/L。

2.1.3 光照對平貝母愈傷組織的影響

表5為光照對培養材料的影響，從表中可以看出光照和黑暗條件下均能獲得平貝母的愈傷組織。黑暗條件下平貝母愈傷組織的誘導率最高，并且愈傷組織呈黃色，較松散，脫分化速度較快；強光下平貝母愈傷組織的誘導率最低，愈傷組織呈淺綠色，質地密，脫分化速度慢。

2.2 平貝母器官發生的誘導

2.2.1 平貝母不定芽的誘導

表6為平貝母不同部位外植體不定芽的誘導效果。由表可以看出不同外植體不定芽誘導率差異較大。其中誘導率最高的為頂芽外植體，其誘導率為75%；莖段外植體的不定芽誘導率為60%；葉片的誘導率最低僅為12.5%。

2.2.2 植物激素種類和濃度對平貝母芽分化的影響

為了研究BA、NAA和2，4-D對平貝母不定芽誘導的影響，本實驗采用L9（33）正交試驗。各因素和水平均如表7所示，試驗重復3次，每個實驗的樣本數大于30個。

表8表9為添加不同激素后正交試驗方案與實驗結果及方差數據。從表中可知三種激素對平貝母不定芽誘導率產生影響的主次順序為NAA>BA>2，4-D，也可得出NAA0.5mg/L、BA 1.0mg/L的組合是誘導不定芽產生的最佳激素。

2.2.3 光照對不定芽分化增殖的影響

表10為光照對平貝母不定芽分化增殖的影響。由表中可以看出，在黑暗條件下，增殖系數最高的為不定芽。而在強光下不定芽的生長系數最高，但隨著培養時間的延長，強光下的培養物中愈傷組織的部分會出現褐化現象。而弱光下的組織則生長狀態良好。因而，黑暗條件有助于平貝母不定芽的增殖，而強光條件則會使不定芽生長、成苗的速度加快。

3 討論

影響體胚的發生和發育的一個重要因素是植物離體培養的條件，而這個條件包括外部條（如培養基種類、光照與否、植物生長調節物質的濃度和種類）和內部條件（如外植體的取材部位和取材時間）。本實驗研究結果表明，平貝母的莖段適宜誘導胚性愈傷組織，誘導率可達77.5%，而葉片的誘導率較低只有10%。這與袁藝[8]等報道的浙貝母葉片誘導愈傷組織的誘導率為10%～13.3%一致，這說明平貝母愈傷組織的誘導率與外植體取材部位有關。莖段的誘導率較高的原因可能是由于接種后莖段膨大、開裂，而愈傷組織較易在傷口處形成。葉片接種后雖也有膨大、和邊緣卷曲現象，由于其分化程度較高，在接種后較難進入脫分化過程，因此只有較少部分在邊緣長出黃色愈傷團。并且由于品種不同，培養條件也不同，因此實驗結果也可能存在出現微小差異。

本實驗研究結果還表明不管是強光還是弱光都在一定程度上抑制了愈傷組織的產生和生長，這可能與光照條件下植物組織會在不同程度上形成已分化狀態的維管組織有關。實驗中由不同外植體直接誘導不定芽時發現，頂芽的誘導效率最高為75%，這個結果高于莖段和葉片的誘導率60%和12.5%，這與王躍華（2010）等的川貝母葉片的鱗莖誘導率32%不完全一致，出現這樣的結果可能與頂芽屬于植物的頂端分生組織，生長活躍，頂芽內的激素的種類和水平與莖段和葉片內的都不同有關。在植物組培過程中，外源激素必須通過外植體中的內源激素發揮作用[9]。而本實驗中不定芽誘導過程中頂芽的誘導效率最高，這可能是由于頂芽中的內源激素和培養基中添加的外源激素共同作用后，促使激素水平更有利于不定芽的產生。

參考文獻

[1] 朱四易.中國貝母屬植物研究[M].西安：西北大學出版社，1995.

[2] 王文杰.貝母[M].北京：中國醫藥科技出版社，1990.

[3] 高山林，朱丹妮，蔡朝暉.暗紫貝母鱗莖器官營養生長特征和生物堿積累研究.中國藥科大學學報，1992，23（3）：144.

[4] 蘇新，趙嵐.浙貝母鱗莖的定向組培（簡報）.植物生理學通訊，1990，26（5）：19.

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[7] 王躍華，閆勝杰，代勇，等.川貝母不同部位外植體對鱗莖再生的影響.南農業學報，2010，23（6）：20-29.

[8] 袁藝，林宏輝，王萬軍，等.浙貝母鱗莖愈傷組織的誘導及植株再生.西南交通大學學報，2005，40（2）：281-284.

[9] 顏呂敬.植物組織培養手冊[M].上海：上海科學技術出版社，1990.