脂肪酶基因工程菌NJY—1—69產(chǎn)脂肪酶在制備生物柴油中的應(yīng)用

摘要主要考察了水的添加量、催化劑用量、醇油摩爾比、有機(jī)溶劑的添加、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、甲醇流加方式對生物柴油轉(zhuǎn)化率的影響。結(jié)果表明，脂肪酶基因工程菌NJY169產(chǎn)脂肪酶制備生物柴油的最佳工藝條件：水的添加量為0.15%， 醇油摩爾比為3∶1，催化劑用量14%，反應(yīng)溫度30 ℃，反應(yīng)時(shí)間36 h，甲醇流加方式是分3次加入，獲得的生物柴油最高轉(zhuǎn)化率為89%。

關(guān)鍵詞基因工程菌；脂肪酶；生物柴油

中圖分類號TQ645文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2014）24-08116-02

The Application of a Lipase Prepared from an Engineered Fungal Strain NJY169 in the Production of Biodiesel

YAN Lijuan et al （Yun nan Wonfine Biotechnology Co. Ltd， Kunming， Yunnan 650117）

AcstractEffects of water addition amount， dosage of enzymes， the molar ratio of methanol and oil， the amount of organic solvent， duration/temperature of reactions and methods of fedbatch addition of methano on biodiesel conversion rate were investigated. The results showed that the optimal conditions of a lipase produced from an engineered fungal strain NJY169 in the production of biodiesel are： water amount 0.15%， the molar ratio of methanol and oil 3∶1， dosage of enzymes 14%， reaction temperature 30 ℃， reaction duration 36 h， methanol adding for 3 times， the highest conversion rate of biodiesel is 89%.

Key words Engineered fungal strain； Lipase； Biodiesel

脂肪酶因其獨(dú)特的生物學(xué)和化學(xué)性質(zhì)廣泛應(yīng)用于不同工業(yè)領(lǐng)域，尤其是在生物柴油制備中。生物柴油作為柴油的代用品是一種環(huán)境友好的綠色清潔燃料，發(fā)展生物柴油對于保護(hù)石油安全、保護(hù)環(huán)境、促進(jìn)國民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展具有十分重要的意義。由于脂肪酶催化生產(chǎn)生物柴油具有反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)物易回收、醇用量少、無污染排放等優(yōu)點(diǎn)，因而已引起人們廣泛的重視。

1材料與方法

1.1主要試劑及儀器

1.1.1主要試劑。甲醇、正己烷等生化試劑均為進(jìn)口分析純，菜籽油購自超市，脂肪酶基因工程菌NJY169（7.0 U/mg蛋白）為云南創(chuàng)新生物產(chǎn)業(yè)孵化器有限公司實(shí)驗(yàn)室制備。

1.1.2主要儀器。GCMS（G1701EB，美國安捷倫公司）；生化培養(yǎng)箱（SGSP02，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；高速冷凍離心機(jī)（Centrifuge5810 R，德國eppendorf公司）；恒溫調(diào)速搖床（YPWL，上海通特電訊設(shè)備廠）。

1.2試驗(yàn)流程生物柴油工藝流程見圖1。

圖1試驗(yàn)流程1.3生物柴油制備條件優(yōu)化[1-7]

1.3.1 水的添加量。脂肪酶是油水界面酶，水是催化反應(yīng)中必不可少的物質(zhì)，但過量的水又會(huì)使酶的催化活力下降。通過添加不同量的水0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、025%、0.30%（以油的質(zhì)量為基準(zhǔn)），確定水的最佳添加量。

1.3.2 催化劑用量。脂肪酶作為制備生物柴油的催化劑，不同油脂和不同的反應(yīng)體系需要適合自身特定的添加量。通過添加不同量的脂肪酶8%、10%、12%、14%、16%、18%（以油的質(zhì)量為基準(zhǔn)），確定脂肪酶最佳添加量。

1.3.3 醇油摩爾比。生物柴油的生成需要添加一定量的甲醇與動(dòng)物或植物油等中的甘油三酸酯發(fā)生酯交換反應(yīng)，但甲醇太多又會(huì)爭奪脂肪酶反應(yīng)中的必須水，影響脂肪酶的催化效力，通過添加2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1的醇油摩爾比確定最佳的醇油摩爾比。

1.3.4 有機(jī)溶劑的添加。有機(jī)溶劑可以促進(jìn)底物與酶的接觸并使底物更好的溶解，但有機(jī)溶劑的添加也會(huì)對產(chǎn)物有一定的影響。添加相同體積的叔丁醇、正丁醇、異丁醇、正己烷、石油醚、丙酮（與油體積比1∶1）進(jìn)行催化反應(yīng)，確定有機(jī)溶劑的最適添加量。

1.3.5 反應(yīng)溫度。對于不同的催化劑及不同的反應(yīng)體系反應(yīng)溫度不同，過高的溫度導(dǎo)致催化劑失活，溫度太低又使底物反應(yīng)不完全。在25、30、35、40、45、50、55 ℃下進(jìn)行催化反應(yīng)，確定最佳催化溫度。

1.3.6 反應(yīng)時(shí)間。對于不同的催化劑及不同的反應(yīng)體系反應(yīng)時(shí)間不同，時(shí)間長副產(chǎn)物增加，時(shí)間短反應(yīng)不完全，浪費(fèi)底物和催化劑。在12、24、36、48、60、72 h下進(jìn)行催化反應(yīng)，確定最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.3.7 甲醇流加方式。甲醇是試驗(yàn)中不可缺少的反應(yīng)物，大量甲醇對脂肪酶有毒害作用，但可以改變甲醇的流加方式來減少對脂肪酶的毒害。選擇1次性加入甲醇反應(yīng)36 h來測定轉(zhuǎn)化率，和分2、3、4、5、6次加入甲醇來測定轉(zhuǎn)化率。

2結(jié)果與分析

2.1 水的添加量由圖2可知，當(dāng)添加0.15%的水時(shí)，生物柴油的轉(zhuǎn)化率最高。

圖2水的添加量對生物柴油轉(zhuǎn)化率的影響2.2催化劑用量由圖3可知，當(dāng)脂肪酶的添加量<14%時(shí)，隨著脂肪酶的增多，生物柴油的轉(zhuǎn)化率也在增大，但脂肪酶添加量超過14%，生物柴油的轉(zhuǎn)化率幾乎沒有增長。因此確定最佳催化劑用量為14%。

圖3脂肪酶用量對生物柴油轉(zhuǎn)化率的影響2.3醇油摩爾比由圖4可知，當(dāng)醇油摩爾比為3∶1時(shí)轉(zhuǎn)化率最高，隨著醇油摩爾比的增大轉(zhuǎn)化率下降，這可能是醇含量增加對脂肪酶產(chǎn)生毒害作用使轉(zhuǎn)化率下降。因此確定最佳醇油摩爾比為3∶1。

圖4醇油摩爾比對生物柴油轉(zhuǎn)化率的影響2.4有機(jī)溶劑的添加

2.4.1 不同有機(jī)溶劑。由圖5可知，添加正己烷轉(zhuǎn)化率最高，因此確定最佳的有機(jī)溶劑為正己烷。

圖5不同有機(jī)溶劑對生物柴油轉(zhuǎn)化率的影響2.4.2 是否添加有機(jī)溶劑。配制相同的反應(yīng)體系（A）和（B），在（A）中加入正己烷，（B）中不加，30 ℃，搖床150 r/min，反應(yīng)48 h測其轉(zhuǎn)化率，結(jié)果見圖6。由圖6可知，添加正己烷和不加正己烷轉(zhuǎn)化率無明顯差異，因此選擇不加正己烷，即不添加有機(jī)溶劑。

圖6有機(jī)溶劑的添加對生物柴油轉(zhuǎn)化率的影響2.5反應(yīng)溫度由圖7可知，當(dāng)溫度<40 ℃時(shí)，隨著溫度的升高生物柴油的轉(zhuǎn)化率大幅度增加，超過40 ℃生物柴油的轉(zhuǎn)化率逐漸下降，可能是升高溫度導(dǎo)致甲醇揮發(fā)轉(zhuǎn)化率下降。因此選擇最適的催化溫度為40 ℃。

圖7反應(yīng)溫度對生物柴油轉(zhuǎn)化率的影響2.6反應(yīng)時(shí)間由圖8可知，隨著時(shí)間的增加轉(zhuǎn)化率逐漸增大，36 h后雖然轉(zhuǎn)化率也增大但幅度較小，綜合考慮，該試驗(yàn)選擇36 h為最佳反應(yīng)時(shí)間。

圖8反應(yīng)時(shí)間對生物柴油轉(zhuǎn)化率的影響

2.7甲醇流加方式由圖9可知，分3次加入甲醇的轉(zhuǎn)化率最高，因此選擇分3次加入甲醇的方式。

圖9甲醇添加量對生物柴油轉(zhuǎn)化率的影響3 結(jié)論與討論

該研究以云南創(chuàng)新生物產(chǎn)業(yè)孵化器管理有限公司實(shí)驗(yàn)室制備的基因工程菌NJY169產(chǎn)脂肪酶為研究對象，對其制備生物柴油的主要工藝：水的添加量、醇油摩爾比、催化劑用量、反應(yīng)溫度和時(shí)間、甲醇流加方式進(jìn)行了初步研究。結(jié)果表明，最佳工藝條件為：水的添加量為0.15%， 醇油摩爾比為3∶1，催化劑用量14%，反應(yīng)溫度30 ℃，反應(yīng)時(shí)間36 h，甲醇流加方式是分3次加入，獲得的生物柴油最高轉(zhuǎn)化率為89%。

研究發(fā)現(xiàn)基因工程菌NJY169產(chǎn)脂肪酶在添加有機(jī)溶劑和不添加有機(jī)溶劑的情況下轉(zhuǎn)化率無明顯差別。一般情況下有機(jī)溶劑可以促進(jìn)底物與酶的接觸并使底物更好的溶解，ROYON等[8]通過在反應(yīng)體系中添加叔丁醇使轉(zhuǎn)化率提高，NABIL等[9]研究表明添加有機(jī)溶劑可以促進(jìn)脂肪酶催化效率的提高，SOUMANOU等[10]研究表明正己烷可以促進(jìn)轉(zhuǎn)化率提高，LI等[11]用添加叔丁醇的脂肪酶催化生物柴油的轉(zhuǎn)化率達(dá)90%以上。而該重組酶在沒有有機(jī)溶劑的添加下也能達(dá)到相同的轉(zhuǎn)化效率，說明該重組酶在無有機(jī)溶劑的幫助下可以很好地和底物接觸完成反應(yīng)，有一定的研究和利用價(jià)值。

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