剛毛檉柳水通道蛋白ThPIP基因啟動子的克隆及其活性分析

摘要[目的]研究剛毛檉柳水通道蛋白ThPIP基因啟動子的克隆及其活性分析。[方法]采用染色體步移技術，克隆到剛毛檉柳ThPIP基因起始密碼子上游1 241 bp啟動子序列，并通過PLACE和PlantCARE預測啟動子序列中所包含的主要順式作用元件。將該啟動子替換pCAMBIA1301上的35S啟動子，構(gòu)建融合表達基因proThPIP∷GUS，通過基因槍瞬時轉(zhuǎn)化煙草，并進行GUS組織化學染色。[結(jié)果]該啟動子具有活性，能夠驅(qū)動GUS基因的表達。[結(jié)論] 為進一步鑒定該啟動子中的順式作用元件及相互作用的調(diào)控因子奠定基礎，從而為揭示剛毛檉柳ThPIP基因的分子調(diào)控機制提供依據(jù)。

關鍵詞剛毛檉柳；ThPIP基因；啟動子克隆；瞬時表達

中圖分類號S188文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）24-08095-04

Cloning and GUS Activity Analysis of the Promoter of ThPIP Gene from Tamarix hispida

WANG Chao， WANG Yucheng et al（State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding ， Northeast Forestry University ， Harbin ，Heilongjiang 150040）

Abstract[Objective] The aim was to study cloning and GUS activity analysis of the promoter of ThPIP gene from Tamarix hispida. [Method] A 1241 bp promoter sequence of upstream of initial codon of ThPIP gene was obtained from Tamarix hispida by using the genome walking. Sequence analysis of the promoter region revealed several cisactivity elements in the promoter using the PLACE and PlantCARE. Further， the 35S promoter in pCAMBIA1301 was replaced with the ThPIP promoter to drive the βglucuronidase （GUS） gene， the proThPIP∷GUS recombinant construct was generated， which was transient expressed in tabacco leaves by the particle bombardment method. [Result]The histochemical GUS staining showed that the ThPIP promoter had activity and could drive the expression of GUS gene in tabacco leaves.[Conclusion] The study laid the foundation for further identifing the components and regulatory factors of interactions cis， in order to provide the basis for revealing regulatory mechanism of the ThPIP gene.

Key wordsTamarix hispida； ThPIP gene； Promoter cloning； Tansient expression

水通道蛋白（Aquaporins，AQPs），是一類高效特異轉(zhuǎn)運水分子的整合膜蛋白，介導水分跨膜轉(zhuǎn)運，在植物生長發(fā)育以及逆境應答中維持細胞滲透平衡具有重要作用[1]。植物AQPs是一個超家族[2]，高等植物AQPs 根據(jù)氨基酸序列同源性和亞細胞定位可以分為5 類：質(zhì)膜內(nèi)在蛋白（PIPs：plasma membrane intrinsic proteins），液泡膜內(nèi)在蛋白（TIPs：tonoplast intrinsic proteins），類NOD26內(nèi)在蛋白（NIPs：NOD26-like intrinsic proteins），小分子堿性膜內(nèi)在蛋白（SIPs：small basic intrinsic proteins）和未鑒定的膜內(nèi)在蛋白（XIPs：X intrinsic proteins）[3]。迄今為止，已從多種植物中發(fā)現(xiàn)并克隆了編碼AQPs的基因，在擬南芥中有35個[4]，水稻中33個[5]，玉米中36個[6]，楊樹中54個[7]，煙草、菠菜、馬鈴薯和胡蘿卜等植物中都存在AQP基因[8]。雖然目前已經(jīng)克隆了多種植物的AQP基因，但關于該基因表達調(diào)控方面的研究尚少。因此，對該基因啟動子的結(jié)構(gòu)及調(diào)控機制的深入研究將為分子育種提高林木抗逆性提供理論基礎。

啟動子是基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游的一段DNA序列，包含多種順式作用元件，能夠與轉(zhuǎn)錄因子特異性結(jié)合直接影響基因的表達量及表達位點，在轉(zhuǎn)錄水平上參與調(diào)控下游相應基因表達。因此，一定程度上決定了基因表達的時間和空間順序。常用的啟動子按其作用方式及功能分為3類，即組成型啟動子、組織特異型啟動子和誘導型啟動子。目前，在植物表達載體中大多使用組成型啟動子，如花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動子和胭脂堿氨酸合成酶Nos啟動子[9]，使外源基因在植物體內(nèi)部各部位都表達，在植物轉(zhuǎn)基因育種進程中，逆境誘導型和組織特異型的啟動子已成為研究熱點[10]。

檉柳（Tamarix sp.）是一種具有良好的抗旱、耐鹽能力的木本植物，能在含鹽量1%的重鹽堿土上生長，顯示其具有一套有效的抗逆系統(tǒng)及相應的分子調(diào)控機制。目前，盡管已克隆了部分檉柳的抗逆相關基因，并對其功能進行了鑒定，但對抗逆基因啟動子的結(jié)構(gòu)和分子調(diào)控機制研究極少。筆者利用染色體歩移技術從剛毛檉柳中克隆ThPIP基因上游調(diào)控1 241 bp啟動子序列，并將該啟動子通過PLACE和PlantCARE進行生物信息學分析，預測啟動子序列中所包含的主要順式作用元件。構(gòu)建融合表達基因proThPIP∷GUS，通過基因槍瞬時轉(zhuǎn)化煙草，并通過GUS組織化學染色分析剛毛檉柳ThPIP基因啟動子的活性。為進一步鑒定該啟動子中的順式作用元件及相互作用的調(diào)控因子奠定基礎，從而為揭示剛毛檉柳ThPIP基因的分子調(diào)控機制提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料剛毛檉柳（Tamarix hispida）種子采自中國科學院吐魯番沙漠植物園，將種子栽種在溫室中[光照14 h/d，光照強度為400 μmol/（m2·s），溫室的相對濕度為65%～75%，平均溫度為24 ℃]，其生長基質(zhì)為草炭土與沙（1∶3）；野生型小葉煙草（Nicotianatabacum）種子由東北林業(yè)大學林木遺傳育種國家重點實驗室保存。大腸桿菌DH5α感受態(tài)、pCAMBIA1301載體質(zhì)粒、根癌農(nóng)桿菌（EHA105）菌種為東北林業(yè)大學林木遺傳育種國家重點實驗室保存。質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒和PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自OMEGA；染色體步移試劑盒（Genome Walking Kit）、pMD18TMT載體、T4 DNA連接酶、LA Taq和DNA Marker DL2000購自TaKaRa公司；dNTP Mixture、DNA序列合成及測序在上海生工生物工程股份有限公司完成。其他藥品試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

1.2試驗方法

1.2.1剛毛檉柳基因組DNA 的提取。以溫室土培的2月齡整株剛毛檉柳幼苗為材料，采用CTAB法提取整株幼苗的基因組DNA[11]，略有改進。

1.2.2ThPIP基因啟動子克隆及序列分析。利用新一代高通量測序Solexa技術建立剛毛檉柳根組織在NaHCO3脅迫下0、6、24和48 h的4個轉(zhuǎn)錄組[12]，將獲得的Unigenes序列通過NR和SwissProt數(shù)據(jù)庫進行BLASTX比對，得知ThPIP基因全長序列。利用染色體步移試劑盒（Genome Walking Kit），根據(jù)已有序列設計3 條特異引物SP1、SP2和SP3，SP2 的位置設計在SP1 的內(nèi)側(cè)，SP3 位于SP2 的內(nèi)側(cè)。3條特異引物的序列分別為SP1：5’CTATGAACTCAGCTATACATGC3’，SP2：5’GGAGCTGGTGGTGGATCTAC3’，SP3：5’TCTGTGGAGCTGGCTCTGTC3’；隨機引物AP1、AP2、AP3和AP4由試劑盒提供。

參考染色體步移試劑盒提供的說明書，以檉柳基因組DNA為模板，以上述合成的特異引物和隨機引物的不同組合為引物，經(jīng)3輪PCR 反應擴增ThPIP基因上游側(cè)翼序列。PCR擴增的目的條帶通過膠回收試劑盒進行純化回收，回收后的產(chǎn)物與pMDTM18T載體相連，取連接液熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌，進行藍白斑篩選，將鑒定為陽性的菌液通過PCR驗證后，再送至上海生工生物工程有限公司進行測序。

利用分子生物學軟件PLACE（http：//www.dna.affrc.go.jp）[13]和PlantCARE數(shù)據(jù)庫（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）[14]對測序得到的啟動子序列的轉(zhuǎn)錄起始位點、潛在的順式元件等進行預測分析。

2結(jié)果與分析

2.1ThPIP基因啟動子克隆及序列分析以整株剛毛檉柳幼苗的基因組DNA 為模板，利用染色體步移技術，經(jīng)過3輪巢式PCR，得到1條長約1.2 kb的片段（圖2），膠回收該片段并連接至pMDTM18T 克隆載體上，通過序列測序，發(fā)現(xiàn)該序列的3’端87 bp與ThPIP基因相對的Unigene序列完全一致，表明擴增的側(cè)翼序列是ThPIP基因的上游序列，其長度為啟動子序列片段1 241 bp。

圖4在煙草中瞬時表達的GUS組織化學分析3討論

植物在生長和發(fā)育、生理代謝以及響應逆境脅迫過程中，基因調(diào)控主要是在轉(zhuǎn)錄水平上進行。這一過程是通過轉(zhuǎn)錄因子與啟動子上特定的順式作用元件相互作用，特異性地調(diào)控下游基因的表達，進而引發(fā)一系列生理、代謝反應，形成高效有序的基因表達調(diào)控網(wǎng)絡。因而基因啟動子中的順式作用元件則是決定基因表達調(diào)控的關鍵因素，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合何種順式作用元件，決定了其調(diào)控哪些基因的表達。

啟動子在植物基因表達調(diào)控研究中具有重要作用，但在沒有全基因組測序的情況下，啟動子的克隆是一項重要而又艱難的工作，目前有很多克隆啟動子的方法，如載體錨定PCR、反向PCR、接頭PCR、AdaptorPCR和Tail PCR[20]。檉柳是一種優(yōu)良的防風固沙植物，耐干旱、鹽堿、貧瘠、風蝕和沙埋[21]，是研究木本植物抗逆機理的理想材料。但關于檉柳的基因組信息相對匱乏，該研究使用Tail PCR方法，利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中已知的Unigenes序列，高效獲取ThPIP基因的側(cè)翼未知序列，相對其他傳統(tǒng)方法，該方法具有高效、簡便、特異性強、靈敏度高和一次性獲得較長未知序列等優(yōu)點。

研究表明，AQPs基因的表達受鹽脅迫誘導，顯示其參與植物鹽脅迫應答過程[22-23]。此外，AQPs 也參與鹽脅迫下其他信號應答調(diào)控[24-25]。但其在植物耐鹽過程中的調(diào)控機理研究相對較少。該研究利用Genome Walking試劑盒克隆了長度1 241 bp的ThPIP基因啟動子序列，并利用PLACE和PlantCARE對該序列進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該啟動子除具有啟動子的基本核心元件TATAbox，還包含多個與逆境應答有關的順式調(diào)控元件，如MYB1AT、MYBCORE、MYCCONSEN、 WRKY71OS，初步表明該基因可能參與植物的逆境脅迫響應。為了驗證該啟動子的活性，將其構(gòu)建到植物表達載體中，代替35S啟動子驅(qū)動報告基因GUS的表達，基因槍瞬時轉(zhuǎn)化煙草葉片，表明其具有啟動子活性，能夠驅(qū)動GUS基因的表達。為了詳細闡述水通道蛋白ThPIP啟動子功能，還需要進一步的深入研究，如通過酵母單雜交篩選其上游調(diào)控因子，再將啟動子上的元件進行突變或者缺失等驗證與上游調(diào)控因子的互作情況，進而揭示ThPIP基因的功能和分子調(diào)控機制。

參考文獻

[1] MAUREL C，VERDOUCQ L，LUU D T，et al.Plant aquaporins：membrane channels with multiple integrated functions[J].Annu Rev Plant Biol，2008，59：595-624.

[2] KALDENHOFF R，F(xiàn)ISCHER M.Aquaporins in plants[J].Acta Physiol，2006，187（1/2）：169-176.

[3] DANIELSON J，JOHANSON U.Unexpected complexity of the aquaporin gene family in the moss Physcomitrella patens[J].BMC Plant Biol，2008，8（1）：45.

[4] JOHANSON U，KARLSSON M，JOHANSSON I，et al.The complete set of genes encoding major intrinsic proteins in Arabidopsis provides a framework for a new nomenclature for major intrinsic proteins in plants[J].Plant Physio1，2001，126（4）：1358-1369.

[5] SAKURAI J，ISHIKAWA F，YAMAGUCHI T，et al.Identification of 33 rice aquaporin genes and analysis of their expression and function[J].Plant Cell Physio1，2005，46（9）：1568-1577.

[6] CHAUMONT F，BARRIEU F，WOJCIK E，et al.Aquaporins constitute a large and highly divergent protein family in maize[J].Plant Physio1，2001，25（3）：1206-1215.

[7] GUPTA A B，SANKARARAMAKRISHNAN R.Genomewide analysis of major intrinsic proteins in the tree plant Populus trichocarpa：characterization of XIP subfamily of aquaporins from evolutionary perspective[J].BMC Plant Biol，2009，9（1）：134.

[8] LUDEWIG U，DYNOWSKI M.Plant aquaporin selectivity：where transport assays，computer simulations and physiology meet[J].Cell Mol Life Sci，2009，66（19）：3161-3175.

[9] 侯丙凱，夏光敏，陳正華.植物基因工程表達載體的改進和優(yōu)化策略[J].遺傳，2001，23（ 5）：492-497.

[10] HUA Z M，YANG X，F(xiàn)ROMM M E.Activation of the NaCl and drought induced RD29A and RD29B promoters by constitutively active Arabidopsis MAPKK or MAPK proteins[J].Plant Cell Environ，2006，29（9）：1761-1770.

[11] 張娟，張道遠，尹林克.剛毛檉柳基因組DNA提取和RAPD反應條件探索[J].西北植物，2003，23（2）：253-256.

[12] WANG C，GAO C，WANG L，et al.Comprehensive transcriptional profiling of NaHCO3stressed Tamarix hispida roots reveals networks of responsive genes[J].Plant Mol Biol，2014，84（1/2）：145-157.

[13] HIGO K，UGAWA Y，IWAMOTO M，et al.Plant cisacting regulatory DNA elements（PLACE）database[J].Nucleic Acids Res，1999，27（1）：297-300.

[14] LESCOT M，DE HAIS P，THIJS G，et al.PlantCARE，a database of plant cisacting regulatory elements and a portal to tools for in silico analysis of promoter sequences[J].Nucleic Acids Res，2002，30（1）：325-327.

[15] ABE H，URAO T，ITO T，et al.Arabidopsis AtMYC2（bHLH）and AtMYB2（MYB）function as transcriptional activators in abscisic acid signaling[J].Plant Cell，2003，15（1）：63-78.

[16] URAO T，YAMAGUCHISHINOZAKI K，URAO S，et al.An Arabidopsis MYB homolog is induced by dehydration stress and its gene product binds to the conserved MYB recognition sequence[J].Plant Cell，1993，5（11）：1529-1539.

[17] XIE Z，ZHANG Z L，ZOU X，et al.Annotations and functional analyses of the rice WRKY gene super family reveal positive and negative regulators of abscisic acid signaling in aleurone cells[J].Plant Physiol，2005，137（1）：176-189.

[18] YANAGISAWA S.Dof1 and Dof2 transcription factors are associated with expression of multiple genes involved in carbon metabolism in maize[J].Plant J，2000，21（3）：281-288.

[19] ROSS E J H，STONE J M，ELOWSKY C G，et al.Activation of the Oryza sativa nonsymbiotic haemoglobin2 promoter by the cytokininregulated transcription factor，ARR1[J].J Exp Bot，2004，55（403）：1721-1731.

[20] 辛魯生，陽江華，唐朝榮.一種啟動子克隆的改良AdaptorPCR方法及在橡膠樹上的應用實例[J].植物研究，2012，32（3）：296-303.

[21] 楊維康，張道遠，張立運，等.新疆主要檉柳屬植物（Tamarix L.）的生態(tài)類型劃分與生境相似性研究[J].干旱區(qū)地理，2004，27（2）：186-192.

[22] DIDHIOU C J，POPOVA O V，GOLLDACK D.Transcript profiling of the salttolerant Festuca rubra ssp.litoralis reveals a regulatory network controlling salt acclimatization[J].J Plant Physiol，2009，166（7）：697-711.

[23] PRZEDPELSKAWASOWICZ E M，WIERZBICKA M.Gating of aquaporins by heavy metals in Allium cepa L.epidermal cells[J].Protoplasma，2011，248（4）：663-671.

[24] ZHU C，SCHRAUT D，HARTUNG W，et al.Differential responses of maize MIP genes to salt stress and ABA[J].J Exp Bot，2005，56（421）：2971-2981.

[25] MAHDIEH M，MOSTAJERAN A.Abscisic acid regulates root hydraulic conductance via aquaporin expression modulation in Nicotiana tabacum[J].J Plant Physiol，2009，166（18）：1993-2003.