煙草特有N—亞硝胺分析方法研究進展

煙草特有亞硝胺（tobacco specific Nnitrosamines，TSNAs）是在煙草調制、加工等過程中，由煙草生物堿亞硝化作用而產生的一類具有致癌性的N亞硝胺類化合物[1-3]。隨著人們對吸煙與健康問題的日益關注，煙草、煙草制品（包括卷煙和無煙氣煙草制品）和卷煙煙氣中TSNAs含量也備受重視。目前已報道的TSNAs有8種，其中N亞硝基降煙堿（NNN）、4（甲基亞硝胺基）1（3吡啶基）1丁酮（NNK）、N亞硝基新煙草堿（NAT）和N亞硝基假木賊堿（NAB）4種研究較為深入，分子結構如圖1所示。毒理學研究表明，NNN和NNK是強烈的齲齒動物致癌劑[4]，被國際癌癥研究機構（IARC）確定為I類致癌物（IARC Group I）；而NAB和NAT對實驗動物致癌性的證據由于較少，所以IARC認為NAB和NAT對人體的致癌性尚不能確定[5-6]。因此，研究簡便、選擇性高、準確、靈敏的TSNAs檢測分析方法對正確評價吸煙對健康的危害和低危害卷煙的研發具有重要意義。

圖1 4種主要煙草特有亞硝胺（TSNAs）的分子結構1 TSNAs分析方法

由于煙草中TSNAs含量極微，一般在0.001～10 mg/kg[7]，且每一種TSNA含量各異，其中NAB含量相對最少，約為NAT的10%，且難以與NAT 分離，同時受到煙草和煙氣復雜基質的干擾，不易進行準確地定量分析。因此，準確定量測定TSNAs的含量一直是國內外煙草研究人員的挑戰。

早在1964年，Neurath等著手利用薄層色譜法對卷煙煙氣中的TSNAs進行分析，但由于儀器條件的限制，結果不理想[8]。1974年，Hoffmann等利用氣相色譜法成功測定了卷煙煙氣和煙草中的NNN含量，但其靈敏度和選擇性并不能令人滿意[9]。1975年，Hecht等開始利用高效液相色譜儀（HPLC）與質譜儀（MS）聯用的方法定量分析煙草中的NNN[10]。直到同年，熱能分析儀（TEA）問世，較好地解決了煙草、煙草制品及卷煙煙氣中極微量TSNAs的檢測的靈敏度和選擇性問題。隨著現代分析儀器技術的進步，新的TSNAs的檢測方法得到不斷發展，如氣相色譜-熱能分析儀法（GCTEA）[11]、氣相色譜-氮磷檢測法（GCNPD）[12-13]、氣相色譜-選擇離子監測-質譜法（GCSIMMS）[14-15]、氣相色譜-串聯質譜法（GCMS/MS）[16]、液相色譜-串聯質譜聯用法（LCMS/MS）[17]、毛細管區帶電泳法（CZE）[18-19]、近紅外色譜法（NIRS）[20]等。

GCNPD和GCSIMMS檢測技術由于靈敏度的影響，只適用于檢測TSNAs含量較高的煙草、煙草制品或煙氣樣品。近年來新發展的毛細管區帶電泳法、近紅外色譜法檢測技術同樣受到選擇性和靈敏度的影響并未得到推廣應用。GCTEA由于靈敏度高、選擇性強的優點，對所有亞硝基化合物均有響應，使得一系列TSNAs的標準分析方法被建立，但分析時間長，較高的檢測限，且價格昂貴、專用性強，使TEA 的廣泛使用受到了限制。隨著串聯質譜技術的興起，使得LCMS/MS和GCMS/MS技術在對TSNAs檢測應用得到了快速發展。LCMS/MS因其高選擇性和靈敏度，不斷得到國內外推廣應用，并于2011年被CORESTA列為TSNAs推薦方法。而GCMS/MS因其強大的色譜分離能力、良好的選擇性和靈敏度，也被用于主流煙氣中TSNAs的分析檢測。該研究重點綜述了GCTEA、LCMS/MS和GCMS/MS在TSNAs分析檢測中的應用。

2氣相色譜-熱能分析法（GCTEA）

TEA是一種專一性檢測器，僅對亞硝胺和亞硝酸酯有響應，對痕量N亞硝基化合物的高度選擇性和靈敏性，因此，GCTEA方法最早被推廣和應用并被煙草科學研究合作中心（CORESTA）列為測定TSNAs的標準分析方法。其基本原理[21]是：N亞硝胺被裂解釋放出亞硝酰基自由基（·NO），·NO被O3氧化而產生激發態的二氧化氮（NO*2），NO*2衰變回到基態，同時發出特征波長的輻射，通過光電倍增管檢測。輻射強度與·NO濃度成正比，從而可以定量檢測N -亞硝基化合物。如圖2所示。

圖2 熱能分析儀原理李文壽研究開發了一種用GCTEA測定煙草和煙氣中TSNAs的方法，優化了萃取的試驗條件并討論了收集主流煙氣和側流煙氣中TSNAs的方法[22]。謝復煒等通過優化前處理條件采用GCTEA法對國內外較有代表性的98種卷煙樣品主流煙氣中4種TSNAs進行了定量分析，對比分析結果表明，混合型卷煙主流煙氣中TSNAs的含量顯著高于烤煙型卷煙；國外混合型卷煙中NNK的含量高于國內混合型卷煙[23]。王保興等采用氣相色譜/熱能分析聯用儀（GCTEA）測定了63個烤煙樣品中的TSNAs含量，并進行了差異顯著性檢驗，結果表明：①進口煙葉的TSNAs含量明顯比云南煙葉的TSNAs含量高；②云南煙葉TSNAs含量高低順序為NAT+NAB>NNK>NNN，而進口煙葉沒有明顯的規律；③品種對煙葉中TSNAs含量影響顯著，而等級對煙葉中TSNAs含量影響不大[24]。芮曉東等對氣相色譜-熱能分析聯用法測定卷煙主流煙氣總粒相物中NNK含量的測量不確定度進行評定，對測定過程進行了分析，確定了測量不確定度的來源，對各不確定度分量進行了量化，并得出了合成不確定度[25]。2012年，Stepanov等利用GCTEA對萬寶路和駱駝2個品牌的無煙氣煙草制品中TSNAs含量進行了監測，結果發現這些無煙氣煙草制品中的TSNAs含量存在區域差異[26]。2013年，Caraway等利用GCTEA評估了鼻煙消費者對TSNAs的口暴露量[27]。

但該方法也存在一些不足：①前處理步驟比較繁瑣、耗時，易造成TSNAs的損失和轉化。②不能區分與TSNAs共流出的亞硝胺類化合物，干擾TSNAs的準確定量。③測定含量極低的TSNAs時，其靈敏度仍然不夠，會存在NAB無法檢出的問題。尤其是目前新型號的TEA硬件發生了較大的改變，反而其靈敏度較以前的型號大幅度降低，已不能完全滿足烤煙型卷煙的檢測需要。

安徽農業科學2014年3液相色譜-串聯質譜聯用法（LCMS/MS）

液相色譜-串聯質譜（LCMS/MS）聯用技術結合了色譜強大的分離功能和質譜準確的鑒別功能，能很好地分析痕量水平的TSNAs，近年來在煙草、煙草制品及煙氣中的TSNAs分析中發展迅速，詳見表1。降低樣品基質的干擾，提高檢測準確性一直是液相色譜-串聯質譜制約因素。由表1可以看出，LCMS/MS分析方法的研究主要集中在樣品前處理，前處理方法逐漸趨于簡單、快速。

2003年，Wu等用CH2Cl2提取收集煙氣的劍橋濾片，鹽酸溶液反萃取后，采用SPE進一步純化，以d4NNN、d4NNK為內標對主流煙氣中5種TSNAs（NNN，NNK，NNAL，NAT，NAB）進行了LCMS/MS分析[28]。與傳統的GCTEA方法相比，該方法靈敏度更高、選擇性更強。但該方法涉及液液萃取、固相萃取和樣品濃縮等繁瑣的處理過程，限制了樣品的通量。2005年，Wagner等為了簡化前處理步驟，采用0.1 mol/L乙酸銨水溶液直接提取收集煙氣的劍橋濾片，以d4NNN、d4NNK為內標對主流煙氣中4種TSNAs進行了直接分析[17]。該方法縮短了樣品制備時間和分析時間，但對于復雜基質樣品，在無樣品凈化處理情況下，方法的準確性、精密度和回收率都有所下降。2008年，Wu等對LCMS/MS方法進行了進一步的完善，同時使用4種同位素標記物（d4NNN，d4NNK，d4NAT，d4NAB）作內標，降低了復雜樣品基質的干擾[33]。同時采用2個離子對對目標物進行定性和定量，提高了方法的準確性和可靠性。將該方法與GCTEA進行比較，兩者取得了較一致的結果，且具有前處理更簡單、更快，選擇性更強，靈敏度更高，檢出限更低，線性范圍更寬等優點。2010年，Clayton等直接用甲醇提取卷煙濾嘴，以d4NNN、d4NNK、d4NAT、d4NAB為內標對煙蒂中4種TSNAs進行了直接分析，以期評價吸煙者對NAB、NAT、NNK和NNN的口暴露量[35]。2012年，萬文亞等發展了卷煙測流煙氣粒相物中TSNAs的LCMS/MS分析方法，同樣以d4NNN、d4NNK、d4NAT、d4NAB為內標進行LCMS/MS分析，該方法檢測限低，重復性好，適合于卷煙測流煙氣中4種TSNAs的定量分析[42]。2013年，Kim等建立了一種測定電子卷煙替代液中TSNAs的以d4NNN、d4NNK、d4NAT、d4NAB為內標進行LCMS/MS分析方法，采用該方法對韓國市場上可購買到的11個電子煙公司的105個替代液品牌中的4種TSNAs進行了測定[47]。

采用液液萃取或固相萃取凈化樣品，增加穩定的同位素標記物為內標是目前2種主要的降低基質干擾的方法。液液萃取或固相萃取步驟繁瑣、耗時，限制樣品通量，而增加同位素標記物作內標會增加分析成本。但直接提取方法因其前處理簡單、分析時間短等優點而常被采用，即用0.1 mol/L的乙酸銨溶液直接提取最常用，該方法也被CORESTA列為煙草及煙草制品中TSNAs測定的標準方法。同時，LCMS/MS方法也是測定口含煙、鼻煙等新型無煙氣煙草制品中TSNAs的主要方法[48-51]。

5 展望

如何快速、靈敏、準確測定煙草、煙草制品和卷煙煙氣成分等復雜基質中微量甚至是痕量的TSNAs一直是國內外煙草化學研究人員的研究重點。近年來報道分析方法多數以溶劑萃取、固相萃取凈化濃縮等為前處理步驟，分析手段主要以GCTEA、GCMS、LCMS/MS和GCMS/MS方法為主。這些方法普遍存在前處理步驟繁瑣、基質干擾嚴重、樣品分析通量不高以及精密度和準確度不高等不足。盡管通過發展新型固相萃取小柱和同位素內標來提高方法的選擇性和減少基質干擾導致檢測的準確度，但這些方法同樣存在前處理耗時、溶劑消耗大、成本高等缺陷。因此，針對復雜樣品基質，如何從樣品前處理方法、色譜分離模式和檢測器研發方面進行創新和突破，建立一種快速、準確、靈敏度高、檢出限低、重復性好且成本低的TSNAs分析方法仍然是煙草行業當前的一項迫切任務。除了發展采用新型色譜技術，如二維色譜技術等用于復雜基質中TSNAs的檢測，同時采用原位、實時、在線、非破壞、高通量、低損耗的新型質譜技術應用于復雜基質中TSNAs的檢測也將是未來發展方向之一，該技術可對復雜基體樣品進行直接分析，從而很大程度上提高分析效率[58]。

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