乳酸乳球工程菌表達(dá)L—苯丙氨酸解氨酶的工藝優(yōu)化

摘要[目的]提高乳酸乳球工程菌表達(dá)L苯丙氨酸解氨酶的水平。[方法]對(duì)培養(yǎng)基種類、接種量、培養(yǎng)溫度、誘導(dǎo)劑濃度、磷酸甘油二鈉濃度等因素進(jìn)行了優(yōu)化。[結(jié)果]使用DifcoTM M17 Broth培養(yǎng)基培養(yǎng)乳酸乳球菌時(shí)，L苯丙氨酸解氨酶表達(dá)活性最高；磷酸甘油二鈉對(duì)L苯丙氨酸解氨酶表達(dá)活性有較大影響，可提高活性93.8%。通過(guò)正交試驗(yàn)，得到PAL最佳表達(dá)條件為接種量2.0%，培養(yǎng)溫度30 ℃，磷酸甘油二鈉濃度2.0%，誘導(dǎo)劑濃度10.0 μg/L。PAL表達(dá)酶活可達(dá)3.05 IU/ml。[結(jié)論] 在發(fā)酵擴(kuò)大培養(yǎng)中優(yōu)化了L苯丙氨酸解氨酶在乳酸乳球菌中的表達(dá)條件，為今后生產(chǎn)及應(yīng)用提供參考。

關(guān)鍵詞乳酸乳球菌； L苯丙氨酸解氨酶； 工藝優(yōu)化

中圖分類號(hào)S188文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）24-08092-03

Process Optimization of L phenylalanine Ammonialyase Expression in Lactococcus lactis

HUANG Letian et al（Guangzhou Institute of Microbiology，Guangzhou，Guangdong 510000）

Abstract[Objective ]In order to improve the level of L phenylalanine ammonialyase expression in Lactococcus lactis. [Method]The kinds of culture medium， inoculum concentration， incubation temperature， inducer concentration， two sodium glycerophosphate concentration were optimized。[Results] The cultured L.lactis medium using DifcoTM M17 Broth， L phenylalanine ammonia lyase activity is highest； two sodium glycerophosphate on L phenylalanine ammonialyase expression significantly affected the enzyme activity， can improve the activity of 938%. Through the orthogonal experiment， the optimal conditions for PAL expression were inoculum concentration 2.0%， incubation temperature 30 ℃， two sodium glycerophosphate concentration 2.0%， inducer concentration 10.0 μg/L. The expression of PAL enzyme activity was 3.05 IU/ml. [Conclusion] The study optimized expression condition of L phenylalanine ammonialyase in Lactococcus lacti， and provided a reference for future production and application.

Key wordsLactococcus lactis；L phenylalanine ammonialyase；Process optimization

乳酸乳球菌是一種同型發(fā)酵的革蘭陽(yáng)性菌，是公認(rèn)安全的食品級(jí)微生物，對(duì)人畜無(wú)害，長(zhǎng)期以來(lái)被廣泛應(yīng)用于各類乳制品發(fā)酵和生產(chǎn)中。近年來(lái)乳酸乳球工程菌的研究日益受到重視，目前其全基因組測(cè)序工作已完成，隨著一些內(nèi)部調(diào)控元件的發(fā)現(xiàn)，相繼開發(fā)出一系列克隆、表達(dá)和整合載體，促進(jìn)了乳酸乳球菌在分子生物學(xué)方面的大力發(fā)展，其中以NICE為代表的食品級(jí)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)成為現(xiàn)今研究的熱點(diǎn)[1]。

乳酸乳球菌表達(dá)系統(tǒng)比其他表達(dá)系統(tǒng)更具有優(yōu)勢(shì)，利用乳酸乳球菌能夠直接到達(dá)腸道，進(jìn)而誘導(dǎo)表達(dá)。乳酸乳球菌已經(jīng)被開發(fā)出來(lái)用于表達(dá)細(xì)菌和病毒的抗原基因，并產(chǎn)生了有效免疫應(yīng)答，被認(rèn)為是一種理想的表達(dá)載體。陳思維等[2]將人胰島素基因在乳酸菌中表達(dá)并考察其對(duì)非肥胖糖尿病小鼠的作用，為實(shí)現(xiàn)人胰島素基因在乳酸菌中的表達(dá)及探索其用作口服疫苗治療Ⅰ型糖尿病的可行性。龔芳紅等[3]構(gòu)建含幽門螺桿菌（Helibacter pylori）熱休克蛋白A編碼基因的重組載體，并轉(zhuǎn)入乳酸乳球菌，表達(dá)目的蛋白并分析其免疫原性，為幽門螺桿菌基因工程口服疫苗的研究和開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

L苯丙氨酸解氨酶是催化脫掉L苯丙氨酸上的氨而生成反式桂皮酸的酶。人體內(nèi)苯丙氨酸濃度超標(biāo)會(huì)引起苯丙酮尿癥，通過(guò)L苯丙氨酸解氨酶的催化作用，可降低苯丙氨酸濃度，達(dá)到治療效果。筆者對(duì)已構(gòu)建的含L苯丙氨酸解氨酶基因的乳酸乳球工程菌進(jìn)行發(fā)酵擴(kuò)大培養(yǎng)，通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)條件及誘導(dǎo)條件，探尋其最佳表達(dá)工藝，為將來(lái)實(shí)際應(yīng)用提供參考價(jià)值。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌。乳酸乳球工程菌由廣州市微生物研究所提供。

2結(jié)果與分析

2.1不同培養(yǎng)基對(duì)PAL表達(dá)的影響選用MRS培養(yǎng)基、改良型M17培養(yǎng)基、DifcoTM M17 Broth培養(yǎng)基作為試驗(yàn)培養(yǎng)基，考察了這幾種培養(yǎng)基對(duì)PAL表達(dá)效果的影響。MRS培養(yǎng)基是乳酸菌最普遍使用的培養(yǎng)基，工業(yè)上應(yīng)用較多。DifcoTM M17 Broth培養(yǎng)基與改良型M17培養(yǎng)基的主要區(qū)別是前者含有磷酸甘油二鈉，而后者含有磷酸氫二鈉和甘油。各培養(yǎng)基對(duì)PAL表達(dá)的影響結(jié)果見圖1。由圖1可知，PAL在DifcoTM M17 Broth培養(yǎng)基中的表達(dá)效果最佳，分別比MRS培養(yǎng)基、改良型M17培養(yǎng)基高62%和24%，DifcoTM M17 Broth培養(yǎng)基的效果好可能是因其含有磷酸甘油二鈉。盡管DifcoTM M17 Broth表達(dá)效果好，但其成本較貴，綜合考慮宜選用MRS培養(yǎng)基或改良型M17培養(yǎng)基。

圖1不同培養(yǎng)基對(duì)PAL表達(dá)的影響2.2不同接種量對(duì)PAL表達(dá)的影響選用接種量分別為0.5%、2.0%、5.0%、10.0%，各接種量對(duì)PAL表達(dá)的影響見圖2。由圖2可知，當(dāng)接種量為2.0%時(shí)PAL的表達(dá)效果最好。接種量過(guò)小會(huì)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，增加傳代次數(shù)，影響細(xì)胞生成量；接種量過(guò)大會(huì)影響產(chǎn)物合成，且過(guò)多移入代謝產(chǎn)物，不利于PAL表達(dá)。

圖2不同接種量對(duì)PAL表達(dá)的影響2.3不同培養(yǎng)溫度對(duì)PAL表達(dá)的影響由圖3可知，隨著溫度的升高，PAL的表達(dá)量先上升后下降，可能前期溫度的升高有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖，而高溫不利于誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)，導(dǎo)致表達(dá)量下降。PAL在30、35 ℃環(huán)境下的表達(dá)效果最好，考慮到成本因素，最佳表達(dá)溫度為30 ℃。

圖3不同培養(yǎng)溫度對(duì)PAL表達(dá)的影響2.4不同磷酸甘油二鈉濃度對(duì)PAL表達(dá)的影響改良型M17培養(yǎng)基用磷酸氫二鈉和甘油代替磷酸甘油二鈉，結(jié)果其PAL表達(dá)效果比DifcoTM M17 Broth培養(yǎng)基差，所以磷酸甘油二鈉對(duì)PAL的表達(dá)有一定的影響。不同磷酸甘油二鈉濃度條件下PAL的表達(dá)情況見圖4。由圖4可知，隨著磷酸甘油二鈉濃度的增加，PAL的表達(dá)活性也相應(yīng)的遞增，當(dāng)濃度達(dá)到一定值時(shí)，PAL表達(dá)量趨于穩(wěn)定。當(dāng)磷酸甘油二鈉濃度為2.0%時(shí)，表達(dá)效價(jià)為2.52 IU/ml，比不使用磷酸甘油二鈉的效價(jià)高93.8% 。

圖4不同磷酸甘油二鈉濃度對(duì)PAL表達(dá)的影響2.5不同誘導(dǎo)劑Nisin濃度對(duì)PAL表達(dá)的影響由圖5可知，當(dāng)Nisin濃度為0時(shí)，PAL沒有表達(dá)，其酶活為0，表明PAL的表達(dá)受Nisin控制。Nisin濃度從0增加到10.0 μg/L時(shí)，酶活呈上升趨勢(shì)，當(dāng)Nisin濃度在5.0～10.0 μg/L時(shí)，酶活達(dá)最高，此階段PAL表達(dá)與Nisin濃度呈正向關(guān)系。之后隨著Nisin濃度的繼續(xù)增加，PAL的表達(dá)量反而下降，Nisin濃度高于400 μg/L后，酶活急劇下降，Nisin濃度為800 μg/L時(shí)，基本沒有表達(dá)。其原因可能是，Nisin作為一種乳鏈菌肽，具有天然防腐、抑菌作用，當(dāng)Nisin濃度過(guò)高會(huì)對(duì)乳酸乳球菌產(chǎn)生抑制作用。因此，Nisin的最佳誘導(dǎo)濃度為100 μg/L。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2014年3結(jié)論與討論

乳酸乳球菌是一種常用益生菌，主要功效是改善腸道功能，提高機(jī)體免疫力。目前乳酸乳球菌也是最常用的誘導(dǎo)表達(dá)型宿主菌，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。該研究對(duì)L苯丙氨酸解氨酶在乳酸乳球工程菌內(nèi)的表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在利用乳酸乳球菌食品級(jí)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)與疾病相關(guān)的免疫因子和抗原，從而為預(yù)防和治療疾病提供新途徑。該試驗(yàn)考察了培養(yǎng)基種類、接種量、培養(yǎng)溫度、磷酸甘油二鈉濃度、誘導(dǎo)劑濃度等對(duì)PAL表達(dá)的影響，其中誘導(dǎo)劑Nisin的影響作用最大，最佳表達(dá)條件是接種量20%，培養(yǎng)溫度30 ℃，磷酸甘油二鈉濃度為20%，Nisin濃度為100 μg/L。賈興元等[4]將人工合成苯丙氨酸脫氨酶基因在乳酸乳球菌中克隆并進(jìn)行食品級(jí)表達(dá)，以期進(jìn)一步用于治療苯丙酮尿癥的研究，該試驗(yàn)在發(fā)酵擴(kuò)大培養(yǎng)中優(yōu)化了L苯丙氨酸解氨酶在乳酸乳球菌中的表達(dá)條件，為今后生產(chǎn)及應(yīng)用提供參考依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] 李芳，李永明，徐子偉，等.乳酸乳球菌作為基因工程受體菌研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào)，2010（5）：61-64，81.

[2] 陳思維，鐘瑾，還連棟.人胰島素基因在乳酸菌中的表達(dá)及其對(duì)非肥胖糖尿?。∟OD）小鼠的作用[J].微生物學(xué)報(bào)，2007（6）：987-991.

[3] 龔芳紅，賀松，張德純，等.幽門螺桿菌熱休克蛋白A在乳酸乳球菌中的表達(dá)及免疫學(xué)活性分析[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2010（2）：106-109.

[4] 賈興元，陳星，蘇暢，等.人工合成苯丙氨酸脫氨酶基因在乳酸乳球菌中的食品級(jí)表達(dá)[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2006（1）：23-26.