DKK1與腫瘤發展

Wnt信號通路通過促進腫瘤細胞轉化、生長、侵襲轉移和血管生成等過程在腫瘤發生發展過程中扮演著關鍵角色，已成為目前腫瘤研究的熱點[1]。作為Wnt信號通路中重要的分泌型抑制因子，DKK1在腫瘤中的作用亦得到了逐步重視。最新研究表明，分泌性蛋白DKK1（dickkopf-1）在多種腫瘤存在明顯表達異常，并且其表達與腫瘤的病理分期及預后存在明顯的相關性，提示DKK1有可能成為一個新的腫瘤標志物和治療靶點，在腫瘤的診斷、治療和復發監測中發揮重要作用[2-4]。在此本文就DKK1的結構、在腫瘤發生發展、診斷及治療中的作用及其研究前景進行綜述。

1 DKK1基因的發現及結構特點

DKK1為Dickkopf基因家族成員。1998年Andrei Glinka等在研究Xenopus胚胎頭部發育誘導機制的過程中首次發現、克隆并定義了DKK1及其家族，并發現DKK1是誘導胚胎頭部發育的關鍵因子[5]。為了進一步研究其在人類胚胎發育中的作用，1999年Fedi P等[6]克隆了人類的DKK1基因。人類DKK1基因位于10q11.2，約3.5kb，編碼一個長約266個氨基酸、分子量大小為28.7KDa的分泌型糖蛋白[7]。在胚胎時期，DKK1在腎臟中表達最強，其次為肝臟和腦部；在出生后，主要表達于胎盤和前列腺中[8]。DKK1蛋白的亞細胞定位主要位于胞漿，結構上包含一個N端的信號序列、兩個保守的富半胱氨酸區域（Dkk_N和輔脂肪酶折疊區域）和一個靠近蛋白質C端的N-糖基化位點。其中信號序列由20～30個氨基酸組成，負責DKK1肽鏈穿越粗面內質網膜和介導DKK1分泌至細胞外[8]；輔脂肪酶折疊區域是由一個多個短的β折疊和二硫鍵構成的類指結構，可與Wnt受體LRP5/6及另一類穿膜蛋白Kremen1/2結合形成三聚體、誘導其內吞而抑制Wnt信號通路，是DKK1蛋白發揮功能的平臺[9-11]； Dkk_N區域為一個包含有一個保守半胱氨酸序列的富半胱氨酸區域，其在Dickkopf蛋白中位置的變化不但是Dickkopf家族不同成員間相互區別的標志，也是調節Dickkopf家族蛋白對Wnt信號通路正向或負向調控的關鍵結構[12]。DKK1的轉錄調節機制非常復雜，除Wnt信號途徑本身能通過β-catenin誘導DKK1表達對其自身進行負反饋調節外[13]，野生型p53[14]、糖皮質激素[15]、孕激素[16]、DNA損傷[17]等均可誘導DKK1的表達，其精確的調節機制仍待進一步探討。

2 DKK1的生物學功能

Wnt信號通路是細胞信號通路中最經典、最重要的信號通路之一，廣泛參與了細胞的增殖、凋亡、細胞遷移及血管發生等過程，不僅在胚胎發育調控過程中發揮著中樞作用，而且與腫瘤的發生發展也具有密切關系[18]。DKK1作為Wnt信號通路的重要調節因子，亦廣泛參與了上述過程并對其產生著重要影響。

2.1 DKK1與細胞凋亡 細胞凋亡（apoptosis）又稱生理性細胞死亡（physiological cell death，PCD） 是指機體為更好地適應生存環境，由基因控制的細胞自主的有序的死亡。正常的細胞凋亡在胚胎時期能清除多余的和已完成使命的細胞，維護胚胎的正常發育；在出生后能清除衰老和病變的細胞，保護機體的健康，是促進生物體進化、維持機體內環境的穩定和胚胎正常發育的重要機制。P53、c-myc、Bcl-2家族、Caspase家族等是調節細胞凋亡的主要基因[19]。上述基因表達失調或功能缺陷可導致細胞凋亡抑制而有利于腫瘤細胞的惡性轉化和增殖，是腫瘤發生發展的重要機制。最近研究表明，DKK1在促進腫瘤細胞凋亡過程中發揮著重要作用。2000年美國佐治亞州立大學Jian Wang等[14]通過cDNA消減雜交技術發現在P53過表達的人肺腺癌細胞系H1299中存在DKK1表達明顯上調。對DKK1的轉錄啟動子序列的進一步研究表明，在DKK1轉錄起始部位上游2.1 kb處存在P53蛋白的結合位點，并且只有野生型的P53而不是突變型P53能激活DKK1的轉錄，說明P53可能通過誘導DKK1的表達而抑制Wnt信號通路、發揮其抑癌基因作用。2002年Jiang Shou等[17]進一步研究發現，在膠質母細胞瘤U87MG中轉染DKK1表達質粒后可明顯促進烷化劑BCNU、卡鉑、喜樹堿等誘導的細胞凋亡，細胞的凋亡與DKK1表達水平呈明顯負相關。并且DKK1的過表達可降低胞內β-catenin和出現細胞端粒的縮短和活性降低，說明DKK1可通過對Wnt/β-catenin經典信號通路和端粒活性的調節而促進細胞凋亡。除了通過Wnt/β-catenin之外，DKK1還能通過Wnt/JNK等信號通路誘導細胞凋亡。2004年Amie Y. Lee等[20]建立了β-catenin表達缺失的間皮瘤細胞H28 DKK1過表達模型。發現即使在β-catenin表達缺失的情況下，DKK1的過表達仍然能有效地促進H28細胞的凋亡，并且其凋亡水平與DKK1過表達的肺癌細胞系H450（有β-catenin表達）相似，且均存在Wnt信號通路轉錄調節基因DVL-3和suvivin的表達下調。但間皮瘤細胞H28的凋亡在加入JNK特異的阻斷劑SP600125后明顯下降。說明DKK1能通過Wnt/β-catenin、Wnt/JNK等多條信號通路的途徑調控細胞凋亡。DKK1促凋亡功能的缺失可能是部分腫瘤發生發展的重要機制。

2.2 DKK1與細胞增殖 細胞過度增殖是腫瘤的主要特征，其機制主要來源于3個方面：細胞周期失控、生長接觸性抑制的喪失和定著依賴性（anchorage dependence）的喪失。恢復腫瘤細胞的正常細胞周期、接觸性抑制和定著依賴性可以達到抑制腫瘤生長、增殖，是目前腫瘤研究的熱點。在腫瘤細胞中，過度激活的Wnt信號可通過上調C-MYC、Cyclin D1和下調細胞粘附因子而達到促進細胞周期失控、生長接觸性抑制和定著依賴性的喪失的目的。

作為Wnt信號的調控因子，DKK1在調節細胞的增殖過程中扮演這雙重角色。在部分細胞中，DKK1是刺激細胞從生長停滯期進入對數生長期的關鍵蛋白。早在1997年Bruder等學者就發現在體外培養人間充質干細胞（hMSCs）的過程中，hMSCs在進入對數生長期前都要經歷3～5 d的生長停滯期，而將處于對數生長期的hMSCs的培養基加入剛替換新鮮細胞培養基的hMSCs中可促進其分裂增殖，這說明在對數生長期的hMSCs的培養基中存在某種刺激因子能促進hMSCs分裂增殖。為進一步明確其機制，2003年Carl A. Gregory 等采用包含[35S]-甲硫氨酸的培養對hMSCs進行培養，以標記和監測在細胞培養基中新出現的分泌性蛋白。結果顯示，DKK1在hMSCs由生長停滯期進入對數生長期的過程中明顯升高，并在hMSCs生長進入穩定期后逐漸降低。說明DKK1可能在誘導hMSCs分裂增殖的過程中發揮了重要作用。為了進一步驗證這一設想，Carl A. Gregory等在處于生長停滯期的hMSCs培養基中加入了人工合成的DKK1蛋白。結果顯示該培養基中hMSCs的增殖明顯早于培養基中未加入DKK1蛋白的hMSCs，并且增殖速度明顯增快。對hMSCs增殖前后的cDNA芯片及免疫熒光檢測顯示，當hMSCs培養基加入DKK1蛋白后，其核內及細胞骨架上的β-catenin的表達明顯減少，并出現JNK信號通路活性明顯減低及血管細胞粘附分子-1（VCAM-1）表達下降。而在hMSCs培養基中加入DKK1抗體能明顯抑制hMSCs細胞的分裂增殖。說明對于hMSCs DKK1可通過抑制Wnt/β-catenin和Wnt/ JNK信號通路并通過降低細胞粘附抑制接觸性抑制而促進hMSCs的分裂增殖。為了進一步驗證其對腫瘤細胞增殖的調控，Carl A. Gregory 等將DKK1抗體加入存在DKK1蛋白表達骨肉瘤細胞系（MG-63）的培養基中，MG-63細胞系的生長停止，說明DKK1是影響該類腫瘤細胞增殖的關鍵因素。與上述現象不同的是，在后來的研究中也有學者發現，DKK1能抑制多種DKK1表達缺失的腫瘤細胞的生長尤其是錨定非依賴性的生長，如宮頸癌細胞系Hela、黑色素瘤細胞MDA-MB435、間皮瘤細胞系H28[20]、絨毛膜癌細胞系JEG3等。并且這些細胞在過表達DKK1后，裸鼠成瘤能力明顯下降。從上述研究中可以看出，DKK1對細胞生長的調控在不同的細胞中作用是不同的，這種差異可能是由于各類細胞中DKK1及其他基因的表達譜差異而造成。

2.3 DKK1與細胞遷移 細胞遷移是細胞發揮其生理功能關鍵過程。在胚胎發育過程，對胚胎細胞遷移的適時誘導是胚胎體軸發育、神經系統發育、肢體發育等過程的關鍵機制；而出生后體細胞的適時遷移有利于機體的生長、免疫和自我修復功能。Wnt信號通路是調節細胞遷移的關鍵信號通路之一，它能通過誘導上皮間充質細胞轉化（EMT）關鍵基因MMP7、MT-MMP的表達而促進細胞運動、降低細胞與基質間的粘附，并能通過促進血管生成相關因子C0X-2、VEGF的表達上調，誘導腫瘤血管生成，為腫瘤的生長、轉移提供營養和轉移路徑。DKK1通過對Wnt信號途徑的負調控，對細胞的侵襲轉移產生了重要影響。2006年Jurgen Pollheimer等研究了DKK1對滋養層母細胞SGHPL-5的遷移能力的影響。結果顯示，在SGHPL-5培養基中加入DKK1后，SGHPL-5 在Transwell實驗中的運動能力明顯下降，遷移細胞數由（240%±35%）降至（58%±31%），并且SGHPL-5細胞內Cyclin D1表達水平降至39%，β-catenin表達水平降至41%。說明DKK1能夠通過負調控Wnt信號通路降低細胞的遷移能力。但有趣的是， Takumi Yamabuki等[3]發現在將DKK1過表達質粒轉染入成纖維細胞系NIH3T3和COS-7后，卻能明顯促進上述細胞在Transwell實驗中的侵襲能力。進一步證明了，細胞信號通路是一個復雜的網路系統，DKK1作為Wnt信號通路的細胞外上游作用因子，其功能很可能由于不同細胞間基因的表達差異和突變導致功能存在巨大差異。

2.4 DKK1在人類腫瘤中的表達及其與腫瘤臨床病理特征及預后的關系 與DKK1生物學功能在不同細胞間存在差異相似的是，在不同腫瘤類型中DKK1表達水平及功能亦存在巨大變化。

目前研究顯示，在惡性黑色素瘤和結腸癌組織[2]中DKK1表達水平明顯下降。由于Wnt信號途徑在結腸癌的發生發展過程中扮演著核心角色，作為Wnt信號途徑的重要抑制因子，DKK1在結腸癌的表達調節機制及作用得到了較深入的探討。2005年Gonza lez-Sancho1 JM等[2]在研究結腸癌組織中DKK1表達規律的過程中發現，Wnt/β-catenin信號途徑的激活雖然能促進人宮頸癌細胞系hela細胞和人胚胎腎293細胞中DKK1的表達，但在32例結腸癌患者組織中卻并未發現DKK1的表達上調，甚至在部分病例還出現明顯的下調（15/32）。為了進一解釋這一現象，2006年O Aguilera等[2]對9種結腸癌細胞系DKK1基因啟動子區域的甲基化水平進行了檢測，發現存在DKK1低表達的結腸癌細胞系均存在啟動子區域CpG島的高度甲基化，并且發現DKK1啟動子區域CpG島的高度甲基化僅存在DUCK's C期和D期來源的細胞系。在54例結腸癌標本中，9例DKK1啟動子區域CpG島甲基化的腫瘤亦僅見于DUCK's C期和D期的患者，而Duke's B患者DKK1啟動子區域無甲基化。并且在結腸癌細胞系DLD-1中過度表達DKK1能抑制明顯該細胞的增殖和皮下成瘤能力。這些都說明DKK1的表達下調可能是促使結腸癌發生發展的重要原因，啟動子甲基化可能是導致DKK1在結腸癌中表達下調的重要機制。但同時我們也應該注意到，在54例結腸癌標本中有45例并未存在啟動子的甲基化，這說明在結腸癌的發生發展過程中DKK1的表達還存在除甲基化外的其他調節機制。

與上述腫瘤相反的是DKK1在乳腺癌[3]、肺癌、食管鱗癌[4]、肝細胞癌、肝母細胞瘤和Wilms瘤中表達水平明顯增高。M-A Forget等[3]發現DKK1在乳腺癌組織中的表達明顯高于相應正常乳腺組織（21/73），且主要表達于ER-/PR-、有腋窩淋巴結轉移和有乳腺癌家族史的患者乳腺癌組織中。而在各類乳腺癌中，ER-/PR-乳腺癌組織中DKK1的表達明顯高于ER+/PR-和ER-/PR+的乳腺癌組織；在具有腋窩淋巴結轉移尤其是有10個以上腋窩淋巴結轉移的患者，其表達水平更高。并且腫瘤TNM分期越晚，乳腺癌組織中DKK1的表達水平越高，ⅢC期患者乳腺癌組織的DKK1表達陽性率為100%。預后分析顯示，DKK1陽性表達的乳腺癌患者相對于DKK1表達陰性的患者預后更差。這些都說明，在乳腺癌組織中DKK1的表達與ER和PR受體相關的分子分型有關，其表達上調可能預示著乳腺癌的不良預后，并且DKK1可能參與了乳腺癌的遺傳發生機制。與上述發現相同的是， Takumi Yamabuki等[4]在肺癌和食管鱗癌的cDNA芯片結果中亦發現DKK1在腫瘤組織的表達水平明顯高于相應的正常組織。且在肺癌組織中DKK1表達水平越高，患者生存期越短。尤其有意義的是，多因素回歸分析結果顯示DKK1是除年齡、分化程度和TNM分期外，影響肺癌患者預后的一個獨立危險因素。在280例食管癌患者癌組織標本的免疫組化檢測中，DKK1高表達組食管鱗癌患者中位生存時間明顯低于低表達組患者。這些說明DKK1可能在肺癌和食管鱗癌的發展過程中發揮促癌基因的作用。

DKK1在多種腫瘤中的顯著表達差異及其分泌蛋白的特性使其有可能成為一個新的血清診斷學指標用于腫瘤的診斷、復發檢測和預后分析。目前人們已發現其在惡性黑色素瘤、多發性骨髓瘤、肺癌、胃癌、肝癌等多種腫瘤患者血清中表達明顯上調，并且其表達與腫瘤的分期、復發轉移、預后存在明顯相關性。尤其是在甲胎蛋白表達陰性的肝癌患者中，其診斷敏感性為70.4%、特異性為90%，并可從甲胎蛋白陽性的慢性乙型肝炎及肝硬化等高危患者中鑒別診斷肝細胞癌，鑒別診斷敏感性達69.1%、特異性為84.7%。DKK1蛋白與甲胎蛋白聯合應用，可將肝細胞癌總體診斷率提高至88%。DKK1這一特性對于提高早期肝癌診斷率，檢測肝癌術后復發轉移具有重要意義，成為肝癌血清學診斷中一個新的重要指標。

3結論

綜上所述，DKK1作為Wnt信號途徑的抑制因子，廣泛參與了細胞生長、凋亡及細胞運動的調節，其在腫瘤細胞的表達變化對腫瘤細胞的生物學行為產生了重要影響，并且與腫瘤的臨床病理特征及預后有著重要的聯系。這說明DKK1的異常表達與腫瘤發生發展的存在廣泛的關聯，其在腫瘤中表達特異性高，易于檢測的特點使其有可能成為良好的腫瘤診斷指標及治療靶點，進一步深入研究其調控機制及腫瘤診治過程中價值，對于完善腫瘤發生發展機制，指導腫瘤治療，改善患者遠期預后將具有重要意義。

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編輯/張燕