胃輕癱大鼠胃平滑肌G蛋白表達異常及消痞方干預研究

摘要：目的 探討胃平滑肌細胞G蛋白在胃輕癱發病機制中的作用以及中藥消痞方的防治效果。方法 健康雄性SD大鼠50只隨機分為五組，每組10只，分別為正常對照組、模型組、低劑量治療組、中劑量治療組和高劑量治療組。四氧嘧啶50 mg/Kg靜脈注射1次，建立大鼠糖尿病模型， 大鼠給藥量按臨床成人的劑量，通過體重系數折算成高、中、低劑量，正常對照組和糖尿病模型組給予相應劑量的生理鹽水。營養性半固體米糊法測定胃排空率，放射免疫方法測定胃平滑肌細胞cAMP含量。核酸原位雜交方法和計算機圖像分析系統對平滑肌細胞的Gsα、GiαmRNA的表達進行定量分析。結果 ①胃排空率：模型組及低劑量組較中、高劑量組和正常組明顯減（P<0.05）。②胃平滑肌cAMP含量： 模型組及低劑量組較中、高劑量組和正常組明顯增高（P<0.05）。③Gsα、Giα的基因表達量：GsαmRNA陽性物質呈棕黃色顆粒，位于平滑肌細胞胞漿內，模型組及低劑量組的表達量明顯高于中、高劑量組和正常組（P<0.05）；Giα mRNA陽性物質呈亮紅色顆粒，位于胞漿內，各組之間的表達量差異無統計學意義（P>0.05）。結論 消痞方通過調節胃平滑肌的Gsα-mRNA的表達量及cAMP的含量維持在接近正常水平，對于糖尿病胃運動功能具有保護和改善作用。

關鍵詞：糖尿病；胃肌輕癱；胃排空

中圖分類號：R587.1

胃輕癱是糖尿病的常見合并癥，包括上腹部飽脹、惡心、嘔吐等癥狀[1]， Kassander在1958年首先提出糖尿病胃輕癱的概念[2]。關于其發病機制沒有完全清楚，目前認為可能和以下因素有關：神經病變、高血糖、胃腸激素及ICC細胞異常等[3]，有關胃平滑肌細胞G蛋白表達在其發病機制中的作用，以及中藥的影響目前國內外罕有報道。因此，本文試圖探討胃平滑肌細胞G蛋白在其發病機制中的作用以及中藥消痞方的防治效果。

1資料與方法

1.1動物與分組 健康清潔級成年雄性SD大鼠50只，體質量250～270 g，購自中國軍事醫學科學院。隨機分為5組（每組10只）：正常對照組、模型組、低劑量治療組、中劑量治療組和高劑量治療組。

1.2模型制備及標本采集 實驗大鼠先穩定3 d，然后給予禁食12 h，尾靜脈注射四氧嘧啶50 mg/Kg/次，1 w后測定血糖濃度≥16.7 mmol/L，同時尿糖在（3+）以上確定為糖尿病模型。正常對照組給予等劑量生理鹽水注射，余處理同前。實驗大鼠分籠飼養12 w，每周監測體重、尿糖、24 h進食量，飲水量、尿量。處死動物后剖腹迅速沿胃大彎剪開胃腔，在裝有Kreb液的燒杯內仔細去除胃內容物。剪取胃竇全層1塊1 cm×1 cm組織平鋪于濾紙上置于10%的福爾馬林緩沖液中固定、包埋、切片。

1.3實驗用藥 消痞方由白術、枳實、黨參、炒萊菔子等組成，按比例稱取，水煎、過濾，濃縮為3 g/mL。大鼠給藥量按臨床成人的劑量，通過體重系數折算成高、中、低劑量，分別為20 g/Kg/d， 10 g/Kg/d和5 g/Kg/d，按1 mL/Kg體積灌胃給藥，正常對照組和糖尿病模型組給予相應劑量的生理鹽水。自造模成功第1 d開始至實驗結束，1次/d。

1.4實驗數據測定

1.4.1胃排空率測定 參考文獻方法[4]胃排空率以（1-胃內容物殘留率）表示。實驗大鼠禁食不禁水12 h后，給予營養性半固體米糊灌胃，用量為1 mL/100 g，灌胃30 min后脫頸處死大鼠，剖取全部胃腸，自幽門切跡處取胃，拭干稱重，沿胃大彎剪開胃體，洗去胃內容物后拭干稱凈重，計算胃內容物殘留率=[（全胃重-胃凈重）/半固體米糊重]×100%。

1.4.2胃平滑肌cAMP含量測定 取胃竇組織1塊，撕去粘膜和漿膜層，按試劑盒說明進行組織勻漿。采用放免法測定，具體步驟按試劑盒說明進行（I125-cAMP放免試劑盒購自上海中醫藥大學）。

1.4.3胃平滑肌細胞Gsα、GiαmRNA的原位雜交 同上經石蠟包埋，行5 μm的連續切片，置于Poly-L-Lysine處理過的專用載玻片上。石蠟切片常規脫蠟至水化；3% H2O2室溫孵育10 min去除內源性過氧化物酶；滴加消化液室溫孵育15 min，以暴露mRNA片斷；滴加預雜交液37℃濕盒孵育2 h；0.2×SSC洗3次，5 min/次；滴加雜交液37℃濕盒孵育4 h；梯度SSC洗滌；滴加封閉液，室溫孵育；滴加高敏鏈酶親和素過氧化物酶復合物（SABC） 37℃濕盒孵育40 min；PBS沖洗3次，3 min/次；DAB避光顯色5 min，水洗中止反應；Giα指標采用AEC顯色；復染，脫水，封片。實驗設β-actin 為陽性對照，正義探針為探針對照，無探針雜交液為陰性對照。首先在Olympus光學顯微鏡下初步觀察，以胞漿出現棕黃色顆粒（Gsα），亮紅色顆粒（Giα）為陽性標志，進一步采用Olympus-BX51計算機圖像分析系統采集圖像進行半定量分析，每張切片在高倍鏡下觀察5個視野，測定平滑肌細胞胞漿內陽性物質的光密度，取其平均值進行統計。原位雜交試劑盒購自天津灝洋生物技術有限責任公司。探針序列：Gsα 5'AggTT gTTTT TgATg TCCTg CACTT TggT 3'Giα 5'TggCT CTAAT gATgg CAATg ATggA CTggA 3'

1.5統計學方法 采用SPSS 10.0軟件進行統計學分析。計量資料數據以（x±s）表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1各組血糖、胃排空率和胃平滑肌cAMP含量結果，見表1。

2.1.1胃排空率 模型組較正常組明顯減低（P<0.05）；中、高劑量組和正常組無明顯差異（P>0.05），但較模型組明顯增高（P<0.05）；低劑量組與模型組比較無顯著差異（P>0.05），均顯著低于正常組和中、高劑量組（P<0.05）。

2.1.2胃平滑肌 cAMP含量 模型組較正常組明顯增高（P<0.05）；中、高劑量組和正常組無明顯差異（P>0.05），但較模型組明顯為低（P<0.05）；低劑量組與模型組比較無顯著差異（P>0.05），但均顯著高于正常組和中、高劑量組（P<0.05），見表1。

2.2胃平滑肌Gsα、GiαmRNA定位表達及定量分析

2.2.1胃平滑肌細胞GsαmRNA的定位表達及定量分析 在各組中胃竇平滑肌細胞的GsαmRNA的表達率為100%，陽性物質呈棕黃色顆粒，位于胞漿內。各組間比較結果顯示：中、高劑量組和正常組均顯著低于模型組（P<0.05），但其三組之間無顯著性差異（P>0.05）；低劑量組與模型組比較無顯著差異（P>0.05），但均顯著高于正常組和中、高劑量組（P<0.05）。

2.2.2胃平滑肌GiαmRNA的定位表達及定量分析 在各組中胃竇平滑肌GiαmRNA的表達率為100%，陽性物質呈亮紅色顆粒，位于胞漿內。各組間比較結果顯示：模型組、正常組、低、中、高劑量組，各組之間無顯著性差異（P>0.05），見表2。

3討論

糖尿病胃輕癱目前認為起發病機制包括神經病變、高血糖、胃腸激素及ICC細胞異常等因素，但是其核心問題是胃動力障礙。本文采用半固體米糊法測定胃排空率，結果為大鼠糖尿病模型組胃排空率明顯低于正常對照組，證實了糖尿病模型大鼠胃排空功能下降，與文獻報道結果一致，同時也提示胃輕癱模型成立。

胃腸平滑肌是胃腸運動的具體執行者。它的活動受到神經、激素和旁分泌機制等的調節[5]。神經遞質是通過與平滑肌細胞膜上的G 蛋白藕聯受體相互作用而發揮生物學效應的。G 蛋白藕聯受體與配體結合后，通過其GTP/GDP結合狀態的轉化，在細胞的信號轉導通路中起信號轉換器的作用。其被激活后，調節作為效應器的酶或離子通道的活性，通過影響離子通道的開放或產生的第二信使激活信使依賴的蛋白激酶，從而產生生物效應。G蛋白分為4種亞型：Gsα， Giα， Gq/11α和G12/13α。其中Gsα對效應蛋白起激活作用，Giα對效應蛋白起抑制作用。肌細胞內Ca2+濃度的升高是平滑肌收縮的關鍵和基礎，而介導平滑肌舒張的胞內第二信使主要是cAMP[6]。

腺苷酸環化酶（adenylate cyclase，AC）是位于細胞膜上的G蛋白的效應蛋白。AC催化ATP分解形成cAMP作為第二信使而發揮生物學效應。AC的活性主要靠Gsα，Giα的調節，Gsα活化后對AC的活性起到激活作用促進cAMP的生成；當Giα活化后對AC的活性起到抑制作用繼而減少cAMP的生成。本實驗：①通過放射免疫的方法檢測胃平滑肌細胞cAMP 的含量，結果顯示為糖尿病模型組較正常對照組含量明顯增多；②通過核酸原位雜交的方法檢測胃平滑肌Gsα，Giα-mRNA的表達，并進行半定量分析，Gsα-mRNA結果顯示為糖尿病模型組較正常對照組含量明顯增多、Giα-mRNA結果顯示為實驗的五組之間均無顯著性差異。以上結果說明糖尿病模型大鼠胃平滑肌的Gsα-mRNA的表達量增多，Gsα含量增加，可能導致腺苷酸環化酶（AC）活性增加，進一步引起cAMP含量增加，從而引起胃平滑肌收縮力減低，胃動力障礙，胃排空率下降。

中醫藥是一個偉大的寶庫，在治療胃腸動力性疾病方面有著獨特的優勢。根據糖尿病胃輕癱的臨床表現，現代中醫將其歸為\"痞滿\"或\"胃痞\"的范疇。糖尿病胃輕癱的“痞滿”其病機與糖尿病的基本病機脾虛有著密切的聯系[7]，因此認為其病機為脾虛氣滯，據此我們提出了健脾理氣的治則。消痞方由白術、黨參、 枳實、炒萊菔子組成，方以白術為君，健脾祛濕，助脾運化；以枳實下氣化滯，消痞除滿，為臣。黨參，以助白術補脾養胃之功，增加炒萊菔子，消食除脹，助枳實以消痞除滿。現代中藥研究也證實了白術、黨參、枳實、炒萊菔子等具有改善胃腸功能，促進胃腸動力的作用[8]。

本實驗通過放射免疫的方法檢測胃平滑肌細胞cAMP的含量，結果顯示為糖尿病模型組較正常對照組含量明顯增多、中高劑量組與正常對照組無顯著性差異、低劑量組與模型組無顯著性差異，但均高于正常組、中高劑量組；通過核酸原位雜交的方法檢測胃平滑肌Gsα，Giα-mRNA的表達，并進行半定量分析，Gsα-mRNA結果顯示為糖尿病模型組較正常對照組含量明顯增多、中高劑量組與正常對照組無顯著性差異、低劑量組與模型組無顯著性差異，但均高于正常組、中高劑量組；Giα-mRNA結果顯示為實驗的五組之間均無顯著性差異。

綜上所述，消痞方中高劑量組治療有效，能夠通過調節胃平滑肌的Gsα-mRNA的表達量及cAMP的含量維持在接近正常水平，因此推測對于糖尿病胃運動功能具有保護和改善作用。

參考文獻：

[1]Hasler WL. Gastroparesis[J].Curr Opin Gastroenterol，2012，28（6）：621-628.

[2]Kassander P. Asymptomatic gastric retention in diabetics[J].Ann Int Med，1958，48（4）：797-812.

[3]姚東英，劉菲.糖尿病胃輕癱發病機制的研究進展[J].國際消化病雜志，2011，31（1）：16-18.

[4]段長農，程宜福.小鼠半固體米糊法加活性炭測定胃排空[J].皖南醫學院學報，2002，21（3）：184-185.

[5]朱玉賢，李毅.現代分子生物學[M].3版.北京：高等教育出版社，1997：315-326.

[6]周呂，柯美云.胃腸動力學-基礎與臨床[M].北京：科學出版社，1999：212-226.

[7]尚瑩瑩，黃天生，肖定洪.糖尿病胃輕癱中醫理論及臨床研究進展[J].中醫研究，2013，26（1）：75-77.

[8]張啟榮，李莉，陳德森，等.厚樸、枳實、大黃、陳皮對兔離體胃底平滑肌運動的影響[J].中國中醫藥科技，2008，15（7）：279-280.編輯/肖慧