絞股藍皂甙對人衰老皮膚成纖維細胞增殖調控的影響

摘要：目的 研究絞股藍皂甙對人衰老皮膚成纖維細胞增殖的影響及機制。方法 原代培養并建立人衰老皮膚成纖維細胞系，0、5、10、15 μg/mL絞股藍皂甙處理細胞，24、72、96 h后MTT檢測細胞增殖；72h后流式細胞儀檢測細胞周期。結果 10、15 μg/mL絞股藍皂甙可以促進人衰老成纖維細胞增殖，使S期細胞數增多且呈濃度依賴。結論 絞股藍皂甙可以使S期細胞數增多且成纖維細胞增殖能力增強，具有延緩細胞衰老的作用。

關鍵詞：絞股藍皂甙；成纖維細胞；增殖；衰老；皮膚

衰老是發生在分子、細胞和整個機體水平的一個復雜的進行性的不可逆的過程。體外細胞模型不僅可以重現生物衰老過程，而且可以避免整體研究的諸多不便和干擾因素[1]。成纖維細胞是皮膚真皮中最主要的細胞成分，其結構和功能的異常對皮膚衰老的發生發展有重要影響。絞股藍是葫蘆科草質藤本植物，是五加科之外唯一含有與人參皂甙相似結構皂甙的植物，其皂甙成分具有保護心腦血管、抗腦缺氧、抗腫瘤及抗衰老等藥理作用，并在治療高血脂癥、血管性癡呆、消化道潰瘍以及中風等方面取得了一定的療效，因此引起國內外眾多學者的重視[2]。本文觀察不同濃度絞股藍皂甙（Gyp）對衰老皮膚的成纖維細胞增殖的調控作用，為絞股藍在抗衰老方面的進一步研究及應用提供實驗依據。

1資料與方法

1.1實驗材料及主要試劑 皮膚標本3例，取自施行眼袋切除術和倒睫矯正術的老年女性眼瞼周圍的正常皮膚，年齡55～60歲，由中國醫科大學第四附屬醫院眼科提供。絞股藍皂甙，成都曼思特生物科技有限公司；DMEM培養基、胎牛血清，美國GIBCO公司；胰蛋白酶，美國Sigma公司；磷酸鹽緩沖液（PBS），中國北京中杉金橋生物技術有限公司；其他試劑為國產分析純。流式細胞儀，美國BD公司。

1.2方法

1.2.1建立細胞系及分組 皮膚標本用膠原酶消化，置37℃，5%CO2培養箱中植塊法原代培養，建立衰老的人皮膚成纖維細胞系。實驗選用第3～6代細胞，分為兩組：空白組（A組）和給藥組（B、C、D組）。0、5、10、15 μg/mL絞股藍皂甙處理細胞，24、72、96 h后，MTT檢測細胞增殖情況；72 h后流式細胞儀檢測細胞周期。

1.2.2制備絞股藍皂甙 取0.1 g絞股藍皂甙溶于1 mL二甲基亞砜（DMSO），配成100 mg/mL的貯存液，DMEM培養液倍比稀釋，使其終濃度分別為5、10、15 μg/mL。

1.2.3 MTT法檢測細胞增殖 制備單細胞懸液，接種于96孔板上。分別加入絞股藍皂甙0、 5、10、15 μg/mL，同時根據DMSO的濃度做相應溶劑對照，每例細胞的每一藥物濃度孔及相應溶劑對照孔均做5復孔。另做1孔不加細胞，只加培養液和絞股藍皂甙。共做3塊培養板。培養24、72、96 h時各取出1塊培養板，MTT法檢測各孔吸光度值[3]。

1.3流式細胞儀檢測細胞周期[4] 胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液，PBS洗滌，棄上清，75%乙醇固定，4℃過夜，800 rpm離心5 min，棄上清，冰PBS 洗滌，棄上清，1 mL 冰PBS液重懸細胞，400目尼龍網過濾，加入10 mg/mL的RNase A 2 μL，37℃孵育45 min；加入1 mg/mL的PI染10 μL，4℃避光染色1h，流式細胞儀檢測分析，重復3次。

1.4統計學方法 數據以（x±s）表示，采用SPSS13.0軟件進行統計分析。方差齊時，行單因素方差分析，LSD方法進行多組間兩兩比較；方差不齊時，采用非參數分析進行多組間比較，Dunnett T3方法進行多組間兩兩比較[5]。

2結果

2.1濃度和時間對衰老成纖維細胞增殖的影響 加入不同濃度絞股藍皂甙，培養24 h、72 h、96 h可見，各組細胞均繼續生長，24～72 h，細胞生長較快，72～96 h細胞生長放緩。培養24 h、72 h，與A組比較，B組無促進細胞增殖作用，C組、D組表現為增殖促進（P<0.05），且D組的增殖促進作用更強（P<0.05）。培養96 h，呈飽和狀態，藥物濃度對細胞增殖作用無明顯差異，見圖1。

2.2濃度對衰老成纖維細胞細胞周期的影響 與A組比較，B組無統計學意義（P>0.05）；C組、D組DNA合成期（S期）的細胞數均增高（P<0.05，P<0.01），且D組增高更顯著（P<0.05）。提示較高濃度的絞股藍皂甙使處于S期的細胞數增加，見表1。

3討論

皮膚衰老是內源性和外源性因素（如紫外線、煙塵等）共同作用的結果，因此可以作為研究各種因素對衰老綜合作用的模型[6]。皮膚由表皮和真皮構成，真皮的結構和功能的改變是皮膚衰老多種臨床表現的基礎，成纖維細胞在其中的作用已被越來越多的實驗研究[7]所關注。

細胞的生命開始于產生它的母細胞的分裂，結束于它的子細胞的形成，或是細胞的自身死亡。細胞周期分為間期與分裂期兩個階段，間期又分為DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）與DNA合成后期（G2期）。細胞在S期完成DNA的合成，同時合成與DNA組裝、構成染色質等有關的組蛋白和DNA復制所需要的酶。衰老時成纖維細胞在各細胞周期的細胞分布會發生改變，表現為明顯的間期阻滯，處于間期的細胞的比例隨時間逐漸提高[8]。本實驗證實，經較高濃度絞股藍皂甙作用后，處于S期的細胞比例增高。提示處于DNA合成及其相關活動的細胞增多，絞股藍皂甙對人衰老皮膚成纖維細胞具有增殖促進作用。MTT檢測結果也驗證了這一點，且藥物作用的適宜時間為72 h。96 h無明顯作用可能與細胞生長空間受限，出現接觸抑制有關。

絞股藍皂甙是絞股藍中提取出來的藥效成分，多項實驗研究[9-11]表明其具有抑制腫瘤、抗氧化、增強免疫等藥理作用。絞股藍可以減輕氧化應激[12]對自然衰老小鼠皮膚組織的損傷，延緩皮膚衰老。絞股藍總皂苷含藥血清可能通過抑制NF-κB信號通路[13]，抑制p38MAPK蛋白和c-Jun mRNA表達[14]，延緩皮膚角質形成細胞光老化。本文將MTT比色法和流式細胞儀檢測法結合起來，以評價絞股藍皂甙對體外培養的人衰老皮膚成纖維細胞增殖情況的調控作用。實驗結論可為將絞股藍皂甙在細胞水平應用于延緩皮膚衰老的相關研究提供技術支持，但具體機制及調控因素的作用應需進一步的研究和探討。

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編輯/張燕