妊娠期糖尿病母嬰血清及胎盤內脂素變化及其與胎兒生長發育的相關性研究

王茜等

【摘要】 目的：探討妊娠期糖尿病（GDM）母嬰血清內脂素水平、胎盤及網膜脂肪組織內脂素基因表達及其與胎兒生長發育的關系。方法：采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法測定40例妊娠期糖尿病及55例正常孕婦母血清及新生兒臍血血清中內脂素水平；采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（Real-time PCR）檢測兩組胎盤及網膜脂肪組織內脂素mRNA的表達。結果：（1）GDM組孕婦產前BMI、孕期體重增長、新生兒出生體重高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）；（2）GDM組孕婦血清內脂素水平顯著高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）；GDM組新生兒臍血血清內脂素水平顯著高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）；組內比較，兩組臍血內脂素水平均顯著高于母血內脂素水平，差異有統計學意義（P<0.05）；（3）兩組胎盤組織內脂素mRNA表達有顯著差異，雙△Ct法進行相對定量分析，GDM組內脂素mRNA表達量是對照組的7.826倍；兩組網膜脂肪組織內脂素mRNA表達比較差異無統計學意義（P>0.05）。結論：GDM孕婦血清及臍血內脂素水平的升高可能參與了GDM的發生發展以及胎兒宮內發育的調節，循環中內脂素的變化主要來自于胎盤內脂素基因表達的變化。

【關鍵詞】 內脂素； 妊娠期糖尿病； 胰島素抵抗； 胎盤； 臍血

妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）是威脅孕婦、新生兒健康的常見妊娠期并發癥，可引起妊娠期高血壓疾病、巨大兒、胎兒宮內窘迫和新生兒低血糖等，并可增加子代成年后罹患代謝綜合征的風險。妊娠期糖尿病發病率有逐年上升的趨勢，但其發病機制尚未完全明了。原有理論認為胎盤分泌的激素，如雌激素、孕激素、胎盤泌乳素（HPL）等對胰島素的拮抗是導致GDM發生的原因之一。近年來研究表明，脂肪組織能分泌一類具有影響胰島素敏感性和血糖穩態作用的因子，稱為脂肪細胞因子（adipocytokines）。妊娠期胎盤同樣能夠分泌多種脂肪細胞因子，并參與GDM的發生。其中內臟脂肪素（visfatin）與胰島素抵抗（insulin resistance，IR）、妊娠期糖尿病的關系備受關注。本研究檢測GDM患者母血和臍血血清內脂素水平，研究GDM患者胎盤組織及網膜脂肪組織中內脂素基因表達的變化，旨在探討內脂素與GDM發病及其與新生兒生長發育的相關性。現將研究結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年1-6月在本院產科定期產檢并住院分娩的足月孕婦，參照2011年ADA診斷標準，將孕24～28周診斷為GDM的40例孕婦作為研究組（GDM組），隨機選取同期正常孕婦55名作為對照組。所有研究對象均為單胎妊娠，于37～42周終止妊娠。兩組受試者均無心血管病、無高血壓疾病、無肝腎疾病、無感染、無孕前糖尿病以及甲狀腺疾病，定期行常規產前檢查直至分娩，且孕期唐氏篩查和三維超聲提示低風險。告知患者本項研究相關內容、簽署知情同意書，并取得本院醫學倫理委員會許可。兩組孕婦的年齡、孕次、產次、分娩孕周、孕前BMI比較差異無統計學意義（P>0.05）；GDM組孕婦產前BMI、孕期體重增長、新生兒出生體重高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05），見表1。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床指標的測定 所有研究對象分娩前記錄年齡、孕周、孕次、產次；測量身高、體重（脫鞋、免冠，僅穿內衣褲測量），計算體質量指數[BMI=體重（kg）/身高2（m2）]；詢問孕前體重，計算孕前BMI及孕期體重增長。新生兒出生后，記錄性別、出生體重、身長、頭圍、胸圍，用于判斷新生兒的營養狀況。

1.2.2 血清及組織標本的收集 （1）于分娩前1～3 d清晨采集孕婦空腹靜脈血5 mL，2000 r/min離心10 min，分離出血清；新生兒娩出后斷臍前抽取臍靜脈血5 mL，方法同上分離出血清，放置于-80 ℃冰箱保存，待統一檢測血清內脂素水平。（2）胎盤娩出后立即在無菌條件下選取母體面中央并避開鈣化灶，手術刀切取約1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm大小的胎盤組織2塊，無菌生理鹽水沖洗后立即投入液氮中速凍，然后轉移到-80 ℃低溫冰箱中保存用于總RNA提取。（3）所有研究對象如果行剖宮產術分娩，于術中取1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm大小的網膜脂肪組織2 塊，去除肉眼可見的血管和血塊，無菌生理鹽水沖洗，同胎盤組織標本方法保存。

1.2.3 血清內脂素測定 采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）測定母血和臍血血清內脂素水平，內脂素試劑盒購自美國R&D公司，批內差異<5%。實驗開始前，各試劑均平衡至室溫，嚴格按照說明書將標準品倍比稀釋。分別設空白孔、標準孔、待測樣品空。空白孔加樣品稀釋液100 μL，余孔分別加標準品或待測樣品100 μL，加樣時將樣品加于酶標板底部，不觸及孔壁，避免氣泡，輕輕晃動混勻，酶標板覆膜，37 ℃溫育2 h。棄去液體，甩干，每孔加臨用前配制的檢測溶液A工作液100 μL（生物素化抗體溶液），酶標板覆膜，37 ℃溫育1 h。棄去孔內液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1～2 min，甩干。每孔加臨用前配制的檢測溶液B工作液100 μL（HRP酶結合物溶液），酶標板覆膜，37 ℃溫育1 h。棄去孔內液體，甩干，洗板5次。每孔加底物溶液90 μL，酶標板覆膜，37 ℃避光顯色，當標準孔的前3～4孔有明顯的梯度藍色，后3～4孔梯度不明顯時終止。以與底物液的加入順序相同的順序加終止液50 μL終止反應，藍色立轉黃色。提前設定好酶標儀（美國BIO-RAD iMark型全自動酶標儀），在450 nm波長測量，直接讀出檢測樣本的濃度值。

1.2.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應（Real-time PCR）檢測內脂素mRNA表達endprint

1.2.4.1 總RNA提取 取面積為0.5 cm×0.5 cm大小的組織樣本在低溫液氮環境下研碎，用Trizol（Invitrogen）法提取總RNA。脫氧核糖核酸酶Ⅰ去除混雜的基因組DNA。NanoDrop測定RNA濃度，測得所提取的RNA OD 260/OD 280在1.8～2.0之間。1%瓊脂糖凝膠電泳見28、18 s和5 s RNA條帶清晰，表明RNA相對分子純度良好，無降解。

1.2.4.2 Real-time PCR反應 參照逆轉錄試劑盒（Takara）操作說明書合成10 μL cDNA，采用兩步法Real-time PCR試劑盒（SYBR Green）（Takara）擴增內脂素及內參磷酸甘油脫氫酶（GAPDH）基因片段。內脂素基因擴增引物序列，上游：5-TGGAAACCCTCTTGACTGTGT-3，下游：5-GACGTTAATCCCAAGGCCATTAG-3，PCR擴增片段長度為298 bp。內參照GAPDH 引物序列，上游：5-CTTAGCACCCCTGGCCAAG-3，下游：5-GATGTTCTGGAGAGCCCCG-3，PCR擴增片段長度為146 bp。所需引物均由上海生工生物工程有限公司合成。循環條件為95 ℃ 10 min，然后95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，共40個循環。使用Roche 480實時熒光定量PCR儀測出樣品內脂素及GAPDH的Ct值。用雙△Ct法計算內脂素mRNA相對于GAPDH的豐度。

1.3 統計學處理 使用SPSS 16.0統計學軟件對數據進行處理，計量資料以（x±s）表示，比較采用t檢驗，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組孕婦血清及新生兒臍血內脂素水平比較 GDM組孕婦血清內脂素水平顯著高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）；GDM組新生兒臍血血清內脂素水平顯著高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。組內比較，兩組臍血內脂素水平均顯著高于母血內脂素水平，差異有統計學意義（P<0.05），見表2。

2.2 兩組胎盤組織和網膜脂肪組織內脂素mRNA表達水平比較 實時熒光定量PCR數據顯示內脂素mRNA在兩組胎盤組織樣本中均能檢測到，熔解曲線均為單峰。GDM組△Ct值為（2.395±0.302），對照組為（5.028±1.179）；將兩組樣本△Ct的均數進行t檢驗，差異具有統計學意義（P<0.05）。用雙△Ct法進行相對定量分析，GDM組內脂素mRNA表達量是對照組的7.826倍。GDM組中19例行剖宮產術分娩，對照組21例行剖宮產術分娩，術中取得網膜脂肪組織樣本均能檢測到內脂素mRNA表達，但兩組間表達差異無統計學意義（P>0.05）。

3 討論

GDM是指妊娠期首次發生或發現的糖代謝異常，一般可在產后恢復正常。IR是GDM重要的發病環節，目前研究認為胎盤分泌的激素以及脂肪組織分泌的細胞因子與孕期IR有關，并可能在GDM發生過程中發揮著重要作用[1]。

內脂素在1994年首次被發現，曾被命名為前B細胞克隆增強因子（pre-B-cell colony-enhancing factor，PBEF）[2]，之后，此蛋白又被鑒定為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸生物合成中的限速酶，命名為煙酰胺磷酸核糖基轉移酶（nicotinamide phosphoribosyltransferase，Nampt）[3]。2005年，Fukuhara等[4]發現此蛋白在內臟脂肪組織中高表達，故命名為內臟脂肪素，簡稱內脂素。內脂素的一大特點是具有擬胰島素作用，且具有劑量依賴性。妊娠期是孕齡婦女脂肪組織和體重增加最快的時期，適度增加的脂肪組織有利于胎兒的正常發育。普遍認為，妊娠期血清或血漿內脂素水平會增高[5-6]。妊娠期內脂素合成和分泌來自兩個方面。一方面，內臟脂肪組織能夠產生內脂素，另一方面，胎盤和胎膜也能產生內脂素[5，7]。內脂素在妊娠期有3個作用：母兒葡萄糖轉運、對抗胰島素抵抗、預測胰島素敏感性[5]。

妊娠期糖尿病作為一種妊娠期代謝綜合征，常常與肥胖、脂肪過度堆積等相關聯，但GDM孕婦內脂素水平的變化存在爭議。一方面，有研究認為GDM孕婦循環內脂素水平低于正常孕婦，這些學者認為內脂素低水平是引起GDM胰島素抵抗的原因之一[6，8-10]。本研究中筆者對比40例妊娠期糖尿病患者和55名健康孕婦靜脈血清中的內脂素水平發現，GDM患者循環中內脂素的水平高于正常孕婦，GDM患者胎盤組織中內脂素mRNA表達也較正常孕婦增加，差異均有統計學意義（P<0.05）。兩組網膜組織中內脂素mRNA表達無顯著差異，提示循環中升高的內脂素可能主要來源于胎盤。以上結果與Krzyzanowska等[11]的研究結果一致：孕晚期GDM孕婦內脂素水平高于正常孕婦，其水平隨孕周增長不斷升高，且在產后哺乳期仍不斷增高。Lewandowski等[12]報道，OGTT試驗2 h時，GDM孕婦內脂素水平高于正常孕婦，且與空腹和OGTT-2 h胰島素濃度正相關。根據以上結果筆者認為，GDM內脂素水平增高是對胰島素抵抗狀態和高糖狀態的一種反饋或對抗，由此起到維持血糖穩態的作用。GDM孕婦體內處于慢性炎癥狀態，TNF-α水平比正常孕婦和未孕婦女高[13]，而TNF-α增加胎盤和脂肪細胞內脂素表達[6]，故推測TNF-α水平增高可能是GDM孕婦高內脂素水平的內在機制。

筆者的研究發現GDM組孕期體重增加量和分娩時BMI明顯高于對照組，提示GDM患者孕期的體重過度增加可能與Visfatin的水平上升相關。GDM患者存在嚴重的胰島素抵抗，刺激脂肪組織及胎盤產生更多量的內脂素，內脂素有“類胰島素樣作用”調節體內血糖、血脂代謝。同時內脂素通過自分泌和旁分泌方式又促進了前脂肪細胞分化成熟，促進葡萄糖轉運及脂肪生成和積聚加劇了內臟脂肪的積聚[14]。由此，筆者認為GDM孕婦內脂素的異常升高與孕期體重增加過多存在密切關系。endprint

另外，筆者的研究證實GDM組臍血中內脂素水平顯著高于對照組，推測高內脂素是GDM易產生巨大兒的原因之一。Malamitsi-Puchner等[15]研究發現，臍血內脂素水平與母血水平相似，兩者有明顯相關性，提示胎兒血循環中內脂素可能主要來自母體。而Mazaki-Tovi等[16]也認為GDM產婦和巨大兒均是孕期母體高內脂素的獨立相關因素。

綜上所述，在GDM復雜的發病機制中，內脂素可能參與了孕婦血糖的調節，與GDM的發生發展及胎兒的宮內發育的調節有關。但其具體的作用通路有待于進一步的研究，明確內脂素在能量代謝、炎癥反應等方面的生物學功能，結合其他脂肪細胞因子的改變，有利于揭示脂肪因子與GDM的關系。

參考文獻

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（收稿日期：2014-01-21）（本文編輯：蔡元元）endprint

另外，筆者的研究證實GDM組臍血中內脂素水平顯著高于對照組，推測高內脂素是GDM易產生巨大兒的原因之一。Malamitsi-Puchner等[15]研究發現，臍血內脂素水平與母血水平相似，兩者有明顯相關性，提示胎兒血循環中內脂素可能主要來自母體。而Mazaki-Tovi等[16]也認為GDM產婦和巨大兒均是孕期母體高內脂素的獨立相關因素。

綜上所述，在GDM復雜的發病機制中，內脂素可能參與了孕婦血糖的調節，與GDM的發生發展及胎兒的宮內發育的調節有關。但其具體的作用通路有待于進一步的研究，明確內脂素在能量代謝、炎癥反應等方面的生物學功能，結合其他脂肪細胞因子的改變，有利于揭示脂肪因子與GDM的關系。

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（收稿日期：2014-01-21）（本文編輯：蔡元元）endprint

另外，筆者的研究證實GDM組臍血中內脂素水平顯著高于對照組，推測高內脂素是GDM易產生巨大兒的原因之一。Malamitsi-Puchner等[15]研究發現，臍血內脂素水平與母血水平相似，兩者有明顯相關性，提示胎兒血循環中內脂素可能主要來自母體。而Mazaki-Tovi等[16]也認為GDM產婦和巨大兒均是孕期母體高內脂素的獨立相關因素。

綜上所述，在GDM復雜的發病機制中，內脂素可能參與了孕婦血糖的調節，與GDM的發生發展及胎兒的宮內發育的調節有關。但其具體的作用通路有待于進一步的研究，明確內脂素在能量代謝、炎癥反應等方面的生物學功能，結合其他脂肪細胞因子的改變，有利于揭示脂肪因子與GDM的關系。

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[16] Mazaki-Tovi S，Romero R，Kusanovic J P，et al.Visfatin in human pregnancy： maternal gestational diabetes vis neonatal birthweight[J].J Perinat Med，2009，37（3）：218-223.

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