hUCMSCs并西格列汀對糖尿病大鼠肝臟蛋白激酶B表達影響

聶靜，王顏剛

（青島大學醫學院附屬醫院內分泌科，山東 青島 266071）

間充質干細胞（MSCs）是多潛能、自我更新細胞，能分泌多種營養因子和免疫調節因子，參與各種組織器官的修復［1－3］，近年來 MSCs在糖尿病治療方面作用引起了全球廣泛關注。而人臍帶間充質干細胞（hUCMSCs）具有來源豐富、采集簡便、增殖能力強、免疫原性低等優點，成為MSCs臨床應用最有前途的細胞來源之一［4］。本研究選擇雄性 Wistar大鼠制備鏈脲佐菌素（STZ）誘導的糖尿病大鼠模型，靜脈應用hUCMSCs及聯合西格列汀進行干預，觀察其對大鼠肝臟蛋白激酶B（AKT）表達的影響?，F將結果報告如下。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

取8周齡健康雄性SPF級Wistar大鼠32只，體質量（200±20）g，購自山東魯抗醫藥股份有限公司。hUCMSCs來源于我院中美干細胞中心，其需氧菌、厭氧菌、真菌、支原體等微生物檢測結果均為陰性，細胞表面抗原檢測符合MSCs的表型特征：CD34－，CD45－，HLA－DR－，CD90＋，CD105＋，用PBS稀釋至細胞密度為0.5×109／L。主要試劑如下：DMEM 低糖培養基、胎牛血清、5g／L胰酶、STZ，美國Sigma公司；青霉素及鏈霉素、PBS，西安沃爾森生物技術有限公司；高糖高脂飼料，北京華阜康生物科技股份有限公司；兔抗鼠AKT單克隆抗體，美國Proteintech公司；DAB顯色試劑盒，武漢博士德公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 糖尿病大鼠模型的建立 Wistar大鼠適應性飼養1周，隨機分為糖尿病組（24只）及正常對照組（8只）。糖尿病組先給予高糖高脂飲食6周，然后給予小劑量STZ（30mg／kg）腹腔注射，10d后連續兩次檢測空腹血糖≥11.1mmol／L即認為造模成功，成模后給予普通飼料喂養。正常對照組給予普通飼料喂養。

1.2.2 實驗分組及處理方法 將成功建模后的糖尿病大鼠隨機分為糖尿病對照組、hUCMSCs組以及hUCMSCs聯合西格列汀治療組（聯合組），每組8只。hUCMSCs組：分別在成模后第1、5周給予大鼠尾靜脈注射hUCMSCs，每只2mL（1.0×106個細胞）；聯合組：造模成功后開始給予大鼠西格列汀10mg／（kg·d）灌胃治療10周，分別在造模成功后第1、5周給予大鼠尾靜脈注射hUCMSCs治療，每只2mL（1.0×106個細胞）；正常對照組與糖尿病對照組不予治療。

1.2.3 肝臟組織AKT表達檢測 采用免疫組織化學染色方法進行檢測。成模后第10周處死各組大鼠，取出肝臟組織，置于40g／L甲醛溶液中固定24h，脫水、石蠟包埋、切片，行免疫組化染色檢測，光學顯微鏡下（200倍）觀察各組AKT胞漿著色情況，每張圖片觀察4個視野。AKT定位于細胞質，無背景著色情況下均以細胞漿出現黃色顆粒者為陽性。免疫組化染色結果采用半定量評分方法判定：①計算陽性細胞百分數并賦予分值，≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；②觀察著色強度并賦予分值，無色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。以陽性細胞百分數分值與著色強度分值乘積判定結果：0分為（－），1～4分為（＋），5～8分為（），9～12分為（）。

1.3 統計學處理

采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據處理，數據間比較采用秩和檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

聯合組及hUCMSCs組肝臟組織AKT表達均明顯高于糖尿病對照組，但低于正常對照組，差異有顯著性（Hc＝25.085，q＝3.211～9.275，P＜0.05），聯合組高于hUCMSCs組（q＝5.967，P＜0.05）。見表1、圖1。

表1 各組大鼠肝臟組織AKT表達比較（n＝8，只）

3 討 論

AKT信號通路是胰島素主要的下游分子通路。AKT通過對葡萄糖轉運、糖原合成、糖酵解和糖異生的調節及其基因突變、沉默、敲除和AKT酶活性改變，影響著葡萄糖的代謝及糖尿病的發生、發展。AKT磷酸化通過胰島素依賴的方式進行，可在三個水平上調控葡萄糖代謝。①AKT通過誘導葡萄糖轉運蛋白GLUT1和GLUT3的表達及GLUT4向質膜的移位促進葡萄糖攝?。淮送?，AKT通過增加內吞影響葡萄糖轉運，從而維持血糖穩定［5］。②通過糖原合成酶激酶3（GSK3）促進糖原合成。③通過磷酸果糖激酶2（6－PF2－K）誘導糖酵解。AKT調控嚴密精確，其調控紊亂可引起多種疾病，如糖尿病等。已有研究顯示，AKT敲除的小鼠會出現糖尿病，并且胰島素靶組織對葡萄糖利用減少［6］。BAE等［7］研究顯示，在AKT基因敲除的脂肪細胞中，通過過表達AKT的方式，可以恢復正常胰島素介導的葡萄糖攝取。

近年來，MSCs在糖尿病治療方面作用引起了廣泛關注。多項研究已經證明，MSCs在體外胰島細胞培養條件誘導下，具有向胰島素分泌細胞分化的潛能，表達與功能性胰島β細胞生成相關的多個基因，并能以葡萄糖依賴方式釋放胰島素，移植到體內能使STZ誘導的裸鼠糖尿病癥狀減輕［8－10］。在各種來源的MSCs中，hUCMSCs因具有來源豐富、易于獲得、采集簡便、免疫原性低等優勢，具有更廣泛的應用與研究價值［11－13］。而西格列?。―PP－4抑制劑）能夠通過減少GLP－1在體內的降解而降低血糖水平，已廣泛應用于2型糖尿病的治療［14］。肝臟是胰島素作用的重要靶組織，本實驗結果顯示，hUCMSCs組及hUCMSCs聯合西格列汀組大鼠肝臟組織中AKT的表達均明顯高于糖尿病對照組，表明hUCMSCs移植能改善糖尿病引起的AKT表達降低。西格列汀可能通過減少GLP－1在體內的降解而降低血糖，從而加強hUCMSCs改善糖尿病大鼠由于血糖過高引起的AKT表達降低作用。

圖1 各組大鼠肝臟AKT免疫組化染色結果

綜上所述，hUCMSCs聯合西格列汀治療能改善因糖尿病引起的AKT表達降低，可能為2型糖尿病治療提供新思路。

［1］CICERI F，PIEMONTI L.Bone marrow and pancreatic islets：an old story with new perspectives［J］.Cell Transplantation，2010，19（12）：1511－1522.

［2］SIMARD A R，SOULET D，GOWING G，et al.Bone marrow－derived microglia play a critical role in restricting senile plaque formatifon in Alzheimer’s disease［J］.Neuron，2006，49（4）：489－502.

［3］VALLE－PRIETO A，CONGET P A.Human mesenchymal stem cells efficiently manage oxidative stress［J］.Stem Cells and Development，2010，19（12）：1885－1893.

［4］LU L L，LIU Y J，YANG S G，et al.Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis－supportive function and other potentials［J］.Haematologica，2006，91（8）：1017－1026.

［5］張青青，董果雄，張社華.全反式維甲酸對兔頸動脈粥樣硬化病灶VSMC增殖及AKT1表達影響［J］.青島大學醫學院學報，2010，46（2）：135－137.

［6］CHO H，MU J，KIM J K，et al.Insulin resistance and a diabetes mellitus－like syndrome in mice lacking the protein kinase Akt2（PKB beta）［J］.Science，2001，292（5522）：1728－1731.

［7］BAE S S，CHO H，MU J，et al.Isoform－specific regulation of insulin－dependent glucose uptake by Akt／protein kinase B［J］.The Journal of Biological Chemistry，2003，278（49）：49530－49536.

［8］劉斌鈺，李寧毅，樊功為，等.大鼠骨髓間充質干細胞的培養鑒定及向成骨細胞誘導分化研究［J］.齊魯醫學雜志，2007，22（3）：215－217.

［9］VOLAREVIC V，ARSENIJEVIC N，LUKIC M L，et al.Concise review：mesenchymal stem cell treatment of the complications of diabetes mellitus［J］.Stem Cells，2011，29（1）：5－10.

［10］XIE Q P，HUANG H，XU B，et al.Human bone marrow mesenchymal stem cells differentiate into insulin－producing cells upon microenvironmental manipulation in vitro［J］.Differentiation，2009，77（5）：483－491.

［11］VERSPOHL E J.Novel therapeutics for type 2diabetes：incretin hormone mimetics（glucagon－like peptide－1receptor agonists）and dipeptidyl peptidase－4inhibitors［J］.Pharmacology＆ Therapeutics，2009，124（1）：113－138.

［12］HARE J M.Translational development of mesenchymal stem cell therapy for cardiovascular diseases［J］.Texas Heart Institute Journal，2009，36（2）：145－147.

［13］LEE J W，FANG X H，GUPTA N，et al.Allogeneic human mesenchymal stem cells for treatment of E.coli endotoxin－induced acute lung injury in the ex vivo perfused human lung［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2009，106（38）：16357－16362.

［14］LEE H，BAE J S，JIN H K.Human umbilical cord blood－derived mesenchymal stem cells improve neurological abnormalities of Niemann－Pick type C mouse by modulation of neuroinflammatory condition［J］.The Journal of Veterinary Medical Science，2010，72（6）：709－717.