番石榴酸對INS-1胰島β細胞增殖、胰島素合成與分泌的促進作用及其機制分析

葉開和，王婧茹，2，馬錦錦，王小康，張曉琦，葉文才，葉春玲

（1.暨南大學藥學院藥理學教研室，廣東廣州 510632；2.瑞典卡羅林斯卡醫學院，瑞典斯德哥爾摩 17177；3.暨南大學中藥與天然藥物研究所，廣東 廣州 510632）

糖尿病（diabetesmellitus，DM）是由胰島素絕對或相對不足引發的以慢性高血糖為主要表現的代謝綜合征，DM及其慢性并發癥已成為繼心腦血管疾病和腫瘤之后人類第3大死亡原因［1］。截至2010年，全球已有 2.85億糖尿病患者［2－3］，其中 90%為2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）患者［4］。T2DM的發病機制雖未完全闡明，但胰島素抵抗（insulin resistance，IR）和胰島β細胞功能障礙是其發生發展的兩個主要環節［5］。對于胰島β細胞，其主要功能為合成、分泌胰島素，胰島素是維持機體正常代謝的關鍵物質。該功能受營養物質、激素、神經等因素的調控。其中葡萄糖是胰島素分泌機制的最重要調控因子［6］。

番石榴（Psidium guajava）為桃金娘科番石榴屬植物。番石榴葉提取物具有抗氧化和清除自由基、降血糖和降血壓等多種藥理活性［7］。本課題組首次發現番石榴葉總三萜（total triperpenoids in Psidium guajava leaf，TTPGL）是番石榴葉降血糖的有效組分（發明專利號：ZL201110100466.5）。動物實驗結果表明，對高脂飲食＋小劑量鏈脲佐菌素（STZ）誘發的2型糖尿病大鼠模型，TTPGL有明顯的抗糖尿病作用，且能明顯升高糖尿病大鼠血清胰島素水平［8］。化學成分研究發現，TTPGL富含高度氧化的五環三萜酸。已初步認為其降血糖的活性部位以烏蘇烷型多羥基三萜酸為主要成分，其中烏蘇酸（ursolic acid）、2α-羥 基 烏 蘇 酸 （2α-hydroxyl-ursolic acid）、積雪草酸（asiatic acid）和番石榴酸（guavenoic acid，GA）四者的總相對含量為50%以上。為進一步研究TTPGL的抗糖尿病作用，弄清總三萜中發揮抗糖尿病作用的活性成分及作用機制，本文將研究GA對INS-1胰島β細胞增殖、胰島素合成與分泌的促進作用及初步作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 大鼠胰島素瘤細胞株，購自中國醫學科學院北京協和細胞資源中心。

1.1.2 主要儀器 SAFIRZ-Z Microplate Reader，

TZCAN，Austria；SN-682B全自動 γ計數器，上海日環儀器有限公司；PTC-1152 PCR儀，BIO-RAD，USA；CFD-3120熒光實時定量 PCR儀，BIO-RAD，USA。

1.1.3 藥品及主要試劑 番石榴酸（見Fig 1），純度95%，由暨南大學中藥與天然藥物化學研究所提供。RPMI 1640培養液（Lot.8112347）、0.05%胰酶-EDTA（1×）（Lot.210175K）、胎牛血清 （Lot.1184652），均購自 Gibco公司；D－（＋）－葡萄糖、2β-巰基乙醇、DMSO，購自 Sigma公司；MTT（Lot.M1959）購自MP；碘［125I］胰島素放射免疫分析試劑盒，購自北京北方生物技術研究所；RIPA裂解液（強）、BCA蛋白定量試劑盒，購自碧云天生物技術研究所；TRIzol，購自 Invitrogen；ReverTra Ace qPCR RT Kit，購自 TOYOBO；SsoFast EvaGreen Supermix qPCR Kit，購自BIO-RAD；DNA引物，委托華大基因合成。格列苯脲，暨南大學中藥與天然藥物化學研究所提供。

Fig 1 Structural formula of Guavenoic acid（GA）

1.2 方法

1.2.1 INS-1胰島細胞的培養 培養條件為含有10%FBS、5.6 mmol·L－1葡萄糖、100U雙抗、50 μmol·L－12β-巰基乙醇的 RPMI 1640培養液；于37℃，5%CO2環境培養。

1.2.2 INS-1胰島細胞增殖的測定 取15～20代INS-1胰島細胞，消化后計數，調整細胞密度至1×108·L－1，接種于96孔板，100μl／孔，分為空白對照組、溶媒對照組（含1‰DMSO完全培養液）、給藥組（0.3、1、3、10、30 nmol·L－1GA）。每個實驗組設置3個復孔，實驗重復3次。種板24 h后，空白對照給予完全培養液，溶媒組與給藥組給予含有相應藥物的完全培養液進行培養，每24 h換液。藥物作用48 h后，棄上清，PBS洗2次后加入120μl含MTT的基礎培養液（1∶5），37℃孵育4 h，酶標儀570 nm，630 nm波長下測定吸光度OD值。以增殖率表示INS-1胰島細胞的增殖程度：

增殖率／%＝（實驗組OD值－空白對照組OD值）／空白對照組OD值×100%

1.2.3 INS-1胰島細胞內胰島素含量的測定 取對數生長期的細胞，消化后計數，調整細胞密度至1×108·L－1，接種于 48孔板，500μl／孔，24 h后將細胞培養液吸去，按分組給藥干預，分為：空白對照組、溶媒對照組（含0.1%DMSO完全培養液）、給藥組（0.3、1、3、10、30 nmol·L－1GA）。每個實驗組設置3個復孔，實驗重復3次。種板24 h后，空白對照組給予完全培養液，溶媒組與給藥組給予含有相應藥物（溶媒）的完全培養液進行培養，每24 h換液。干預作用48 h后，棄上清，PBS洗后加入300 μl／孔HBSS緩沖液于37℃平衡30 min；加入預冷的PBS洗2次。每孔加入400μl酸醇提取液，4℃ 過夜，次日取上清液，800 r·min－1，4℃離心 5 min，取上清于－20℃保存待測胰島素量。同時設置相應的復孔，不使用酸醇提取液處理，用于蛋白提取。樣品于－80℃保存待測蛋白含量，用于校正各孔胰島素量。結果以單位質量胰島素濃度（每孔胰島素含量／相應的蛋白含量）表示，即103IU·L－1·g－1Pro。

1.2.4 INS-1胰島細胞胰島素分泌的測定 取對數生長期的細胞，消化后計數，調整細胞密度至1×108·L－1，接種于 48孔板，500μl／孔，24 h后將細胞培養液吸去，按分組給藥干預，分為：空白對照組、溶媒對照組（含1‰DMSO完全培養液）、分泌模型組（5.6、16.7 mmol·L－1葡萄糖-HBSS溶液）、陽性藥組（150 nmol·L－1格列苯脲，含0.1%DMSO）、給藥組（0.3、1、3、10、30 nmol·L－1GA），其中分泌模型組、陽性藥組、給藥組均分為基礎糖刺激組（BIS）、高糖刺激組（GSIS）。每個實驗組設置3個復孔，實驗重復3次。種板24 h后，空白對照組給予完全培養液，溶媒組、分泌模型組給予含0.1%DMSO的完全培養液，陽性藥組、給藥組給予含有相應藥物的完全培養液進行培養，每24 h換液。干預48 h后，棄上清，PBS洗后加入300μl／孔 HBSS緩沖液于37℃平衡30 min；分泌模型組、陽性藥組、給藥組的基礎糖刺激組（BIS），高糖刺激組（GSIS）分別給予5.6、16.7 mmol·L－1葡萄糖-HBSS溶液，300 μl／孔；空白組、溶媒組給予相同體積 HBSS。37℃孵育1 h后，取上清液，－20℃保存待測胰島素量。使用RIPA提取各孔蛋白，－80℃待測蛋白含量，用于校正各孔胰島素量。結果以單位質量胰島素濃度（每孔胰島素含量／相應的蛋白含量）表示，即103IU·L－1·g－1。

1.2.5 INS-1細胞胰島素及相關轉錄子mRNA表達的測定 取對數生長期的細胞，調整細胞密度至2×108·L－1，接種于 24孔板，500μl／孔，24 h后棄培養液。干預方法及分組同“1.2.2”，其中GA劑量調整為：0.3、3、30 nmol·L－1。藥物作用48 h后，棄上清，PBS洗，按TRIzol實驗手冊提取總RNA，測定樣品濃度與純度后，逆轉錄。參照TOYOBO RT試劑盒進行逆轉錄。以RT產物為模板，加入SsoFast EvaGreen Supermix、對應引物，以10μl體系進行熒光定量 PCR，反應條件為：95℃ 30 s，95℃ 5 s、61℃／59.9℃／58.7℃（Insulin／PDX-1／MafA）5 s共進行45個循環，溶解曲線（65～95）℃（in 0.5℃ inc.）5 s／step。

設計引物序列，分別為：RAT-Insulin引物（上游：5′-CACCCAAGTCCCGTCGTGAAGT-3′，下游：5′-GATCCACAATGCCACGCTTCTG-3′）；RAT-PDX-1引物（上游：5′-GGTGCCAGAGTTCAGTGCTAATC-3′，下游：5′-CTTCCCTGTTCCAGCGTTCC-3′）；RAT-MafA引物（上游：5′-AGGAGGAGGTCATCCGACTG-3′，下游：5′-CTTCTCGCTCTCCAGAATGTG-3′）；內參 GAPDH引物（上游：5′-CCCACTCCTCCACCTTTGAC-3′，下游：5′-TCTTCCTCTTGTGCTCTTGC-3′），委托華大基因進行引物合成。

1.2.6 統計學分析 以上實驗均進行重復性實驗，結果以ˉx±s表示。應用SPSS 17.0統計學軟件對實驗結果進行統計學分析，多組比較用方差分析，兩組間比較用t檢驗，應用GraphPad Prism 5.0軟件繪圖。

2 結果

2.1 番石榴酸對細胞增殖的影響 結果表明，溶媒組與空白對照組比較差異無顯著性。與溶媒對照組比較，較低劑量的 GA（1、3、10 nmol·L－1濃度）能明顯地促進INS-1胰島 β細胞的增殖（P＜0.01），增殖率達（35.7±2.9）%、（51.2±4.4）%、（20.5±1.8）%，見 Fig 2。

2.2 番石榴酸對細胞內胰島素含量的影響 應用放射免疫法測定GA干預48 h后的INS-1胰島β細胞內胰島素含量，用對應的總蛋白量校正。結果表明，溶媒組與空白對照組比較差異并無顯著性。給藥組與溶媒對照組1.77±0.11（103IU·L－1·g－1Pro）比較：GA能明顯地提高INS-1細胞內胰島素含量（P＜0.01），0.3～30 nmol·L－1各濃度作用分別為：6.28±0.72、10.98±0.79、15.45±0.74、11.55±0.81、18.02±1.05（103IU·L－1· g－1Pro）。見 Fig 3。

2.3 番石榴酸對胰島素分泌功能的影響 應用放射免疫法測定INS-1胰島β細胞在GA干預48 h后的BIS、GSIS值，用對應的總蛋白量校正。結果表明，溶媒組與空白對照組比較差異無顯著性。與溶媒對照組（95.5±13.8）IU·L－1·g－1Pro比較，葡萄糖刺激的模型組INS-1胰島β細胞胰島素分泌量有所增加，模型組基礎胰島素分泌 BIS升高至（108.5±10.4）IU·L－1·g－1Pro（P＜0.05），GSIS升高至（186.4±28.3）IU·L－1·g－1Pro（P＜0.01）。與模型組比較，陽性藥格列苯脲組INS-1β細胞的BIS、GSIS均有明顯的升高，分別為：（242.0±20.0）、（338.2±28.0）IU·L－1·g－1Pro（P＜0.01）。上述結果說明分泌模型構建成功。

GA對正常INS-1胰島β細胞的BIS、GSIS作用結果如下：① 與 BIS模型組（108.5±10.4）IU·L－1·g－1Pro比較，0.3 nmol·L－1的 GA便能明顯促進INS－胰島細胞的 BIS能力（P＜0.05），達到（147.9±26.9）IU·L－1·g－1Pro；較高濃度 3、10、30 nmol·L－1促進作用更為明顯（P＜0.01），分別為（203.6±20.0）、（230.6±20.0）、（403.4±24.0）IU·L－1·g－1Pro。② 與 GSIS模型組（186.4±28.3）IU·L－1·g－1Pro比較，0.3～30 nmol·L－1的GA均能明顯地提高INS-1細胞的GSIS能力（P＜0.01），分別為：（257.8±28.8）、（265.9±29.6）、（301.1±20.4）、（287.8±27.2）、（500.6±32.9）IU·L－1·g－1Pro。見 Fig 4。

Fig 2 Effects of GA on proliferation of INS-1 cellsˉx±s，n＝6）*P＜0.05，**P＜0.01 vs medium.

Fig 3 Effect of GA on INS-1 cells intracellular insulin content（±s，n＝6）**P＜0.01 vs medium

Fig 4 Effects of GA on BIS and GSIS of INS-1 cells（ˉx±s，n＝6）△P＜0.05，△△P＜0.01 vs medium；*P＜0.05，**P＜0.01 vs BISofmodel；＃＃P＜0.01 vs GSIS ofmodel

2.4 番石榴酸對 Insulin、PDX-1、M afA mRNA表達的影響 GA干預INS-1胰島β細胞48 h后，提取總RNA并測定其濃度與純度（測定結果A260／280在1.8～2.0正常范圍內），逆轉錄后進行熒光定量PCR擴增，測定GA對INS-1細胞中Insulin、PDX-1、MafA的mRNA相對表達量。結果如下：

2.4.1 Insulin mRNA相對表達 與溶媒對照組（1.20±0.27）比較，0.3、3、30nmol·L－1的 GA均能明顯上調INS-1細胞內Insulin mRNA相對表達（P＜0.01），分別為 3.29±0.48、4.05±0.25、3.16±0.2。見 Fig 5。

2.4.2 PDX-1 mRNA相對表達 與溶媒對照組（0.61±0.03）比較，GA（3、30 nmol·L－1）能明顯上調INS-1細胞內 PDX-1 mRNA相對表達（P＜0.01），達到1.60±0.23、1.58±0.02；而在0.3 nmol·L－1時則表現明顯的下調作用（P＜0.01），相對表達量為 0.13±0.02。見 Fig 6。

Fig 6 Effects of GA on relative RNA expression of PDX-1 in INS-1 cells（±s，n＝6）**P＜0.01 vs medium

2.4.3 MafA mRNA相對表達 與溶媒對照組（0.59±0.11）比較，GA（3、30 nmol·L－1）能明顯上調INS-1細胞內MafA mRNA相對表達（P＜0.01），達到3.94±0.32、3.17±0.26；而在 0.3 nmol·L－1時則表現出明顯的下調作用（P＜0.01），相對表達量為0.16±0.02。見 Fig 7。

Fig 7 Effect of GA on relative RNA expression of MafA in INS-1 cells（±s，n＝6）**P＜0.01 vs medium.

3 討論

胰島β細胞損傷減少的程度是DM發生發展的一個關鍵因素［9－10］。胰島β細胞約占胰島細胞總數的60%～75%，具有合成、分泌胰島素的功能［11］。胰島β細胞數量及其功能的正常發揮，是機體調節糖、脂肪及蛋白質代謝的重要保障［12］。胰島β細胞數量的動態平衡主要取決于細胞增殖、凋亡以及生長因子、葡萄糖與氨基酸等物質［13］。若藥物能夠促進胰島β細胞的增殖，則可能通過增加細胞數量使胰島素分泌量提高，改善糖尿病的糖代謝異常。

目前研究認為磷脂酰肌醇-3激酶－絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶／蛋白激酶 B（PI3K-Akt／PKB）信號通路對調節胰島β細胞數量與功能發揮著十分重要的作用，已證實絲氨酸／蘇氨酸激酶Akt是這條通路中的下游分子，是調節細胞功能與誘導胰島β細胞增殖的潛在靶點［14］。本實驗發現，1 nmol·L－1GA能明顯促進INS-1胰島細胞的增殖，增加胰島素分泌細胞總量，具有明顯的促增殖作用，但其是否作用于PI3K-Akt／PKB信號通路還有待進一步研究。

在基因水平，胰島素的合成受胰島素基因的調控，而在胰島素基因轉錄起始位點上游約－340 bp處存在一個高度保守的區域，該區域的存在保證了胰島素基因表達的組織特異性與受代謝調控的特點。許多轉錄因子結合于該區域，參與到了胰島β細胞功能的調控中，形成了精密的胰島素基因表達調控網絡。其中較為關鍵的啟動子有：胰腺十二指腸同源盒1（pancreatic duodenal homeobox factor 1，PDX-1）、鳥類 MafA蛋白的哺乳動物同系物（mammalian homologue of avian MafA／L-Maf，MafA）［15］等，以上啟動子不但能夠調控胰島素基因的轉錄，對胰島β細胞其他生命過程也有作用。在胰島β細胞中，PDX-1是調節胰腺發育、胰島分化、增殖和維持胰島β細胞功能起關鍵作用的胰腺特異性轉錄因子［16－18］。文獻報道，長期高糖刺激胰島細胞導致嚴重的氧化應激會伴隨PDX-1DNA結合能力的下降，而抑制胰島素基因的轉錄［19］。MafA是編碼RIPE3b（in rat）／C1（in human）激活因子的基因，是最重要的控制胰島β細胞選擇性轉錄胰島素基因的Cisregulatory因子［20］。MafA作為堿性亮氨酸拉鏈轉錄因子，特異性定位于胰島素表達呈陽性的細胞的核上，可通過與PDX-1協同作用在胰島素合成的過程中起到激活胰島素基因啟動子的作用［21］。單獨上調MafA的表達，也可以提高內源性胰島素mRNA的水平［22］。近期研究發現 PDX-1、MafA不單作用于調控胰島素基因的轉錄，對β細胞的GSIS功能也有重要作用［15］。

胰島β細胞分泌胰島素的功能是通過興奮－分泌偶聯機制實現的［23－24］，調節其分泌功能的因子有兩大類：第一類為營養物質，包括葡萄糖、氨基酸與脂肪酸等；第二類為非營養物質，包括神經遞質與激素等［24］。生理狀態下的胰島β細胞能夠接受整合這兩大類因子的信號，將機體內的胰島素分泌維持在正常水平［25］。其中，最及時最主要的調節因素是葡萄糖的水平。胰島β細胞對生理范圍的血糖濃度變化非常敏感，對其產生應答，通過KATP通道途徑調整胰島素的釋放。異常的葡萄糖刺激胰島素分泌（GSIS）是T2DM早期的特征，其特點是基礎分泌升高和減少對葡萄糖刺激的反應［14］。

本實驗選擇INS-1胰島β細胞為實驗對象，側重于INS-1細胞有較高的胰島素含量，對GSIS較為敏感，且該功能在傳代80代內保持穩定；另外，INS-1細胞不合成胰高血糖素與生長抑素，可以排除它們對結果的影響。本實驗結果與INS-1胰島β細胞特性相符，實驗發現INS-1細胞中胰島素含量十分豐富；基礎濃度葡萄糖（5.6 mmol·L－1）和高濃度葡萄糖（16.7 mmol·L－1）均可刺激其釋放胰島素，且對高糖刺激更敏感。以上結果提示，本實驗INS-1細胞胰島素分泌成功建立。

本實驗對INS-1胰島β細胞的細胞內胰島素含量和胰島素分泌功能均進行了探討。結果發現GA能明顯增加細胞內胰島素含量，促進胰島素分泌，對BIS、GSIS均有明顯促進作用，實驗結果表明，GA對胰島素分泌的結果與其增加細胞內胰島素含量的作用相一致。

胰島素合成受胰島素基因的調控，胰島素基因又受PDX-1、MafA等轉錄因子的調控。PDX-1表達缺陷誘導的 glucagon-like peptide-1receptor（GLP-1R）表達下調會影響GLP-1／GLP-1R信號通路，抑制glucagon-like peptide 1（GPL-1）促胰島素分泌的作用，造成胰島 β細胞功能損傷［26－27］。值得注意的是MafA活性的下降與β細胞功能下降的進程相關。研究表明，MafA基因敲除小鼠會出現胰島素分泌受損進而發展為糖尿病，伴隨有Insulin1、Insulin2、PDX-1、GLUT-2基因表達水平的下降［21］。有研究闡明MafA在GSIS調控方面也有重要的作用，過表達MafA會提高GSIS，以及上調β細胞中重要的基因表達（包括 GLUT2、PDX-1、GLP-1等）［28］。MafA可能是一種能夠嚴格調控維持β細胞功能相關基因的關鍵因素，特別是對于GSIS。

本實驗選擇了胰島素基因和對胰島素基因表達、胰島β細胞分泌功能均有作用的轉錄因子PDX-1、MafA作為研究對象，測定GA對以上3種基因mRNA相對表達的作用。結果發現，GA能上調胰島素基因表達；GA增加細胞內胰島素含量的作用靶點可能涉及Insulin基因。

GA在濃度 3、30 nmol·L－1時上調 PDX-1基因表達，此結果與Insulin基因表達結果相一致，說明GA可能是通過PDX-1調控Insulin基因表達，從而增加細胞內胰島素含量。結合分泌功能結果進行作用機制分析，GA可能通過上調PDX-1的表達，提高了INS-1細胞的分泌能力。此外，GA在濃度3、30 nmol·L－1時能夠上調MafA表達，提示其增加細胞內胰島素含量、促進胰島素分泌的作用機制可能與其上調MafA基因表達有關。然而，GA在很低濃度0.3 nmol·L－1時表現的下調 PDX-1、MafA基因表達，其原因需進一步研究。

綜上所述，GA可促進INS-1胰島β細胞增殖、增加細胞內胰島素含量、促進胰島素分泌；其作用機制可能通過上調Insulin、PDX-1、MafA基因的表達。GA可能有利于改善β細胞功能，延緩T2DM及其并發癥的發生和發展。

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