高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法分析克拉屈濱注射液中主要雜質(zhì)及其來(lái)源

楊麗珍,楊偉峰,,石云峰

(1.浙江工業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院,杭州 310014;2.浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院,杭州 310004)

高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法分析克拉屈濱注射液中主要雜質(zhì)及其來(lái)源

楊麗珍1,楊偉峰1,2,石云峰2

(1.浙江工業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院,杭州 310014;2.浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院,杭州 310004)

目的 利用高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(HPLC-Q-TOF-MS)法對(duì)克拉屈濱注射液的主要雜質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定,并分析其來(lái)源。方法色譜柱Grace C18(250mm×4.6mm,5μm),流動(dòng)相為10 mmol·L-1乙酸銨溶液-甲醇(80∶20),柱溫35℃,檢測(cè)波長(zhǎng)為265 nm。以ESI為離子源,在正離子模式下獲得克拉屈濱及其主要雜質(zhì)的質(zhì)譜圖,并推測(cè)雜質(zhì)結(jié)構(gòu)式。分別考察克拉屈濱注射液在pH為4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0溶液及光強(qiáng)為4 500 lx,5%過(guò)氧化氫(H2O2),60℃環(huán)境中的穩(wěn)定性。結(jié)果通過(guò)比較克拉屈濱和主要雜質(zhì)的裂解途徑及其高分辨質(zhì)量數(shù),結(jié)合合成工藝,推斷出該雜質(zhì)為2-氯腺嘌呤,由降解試驗(yàn)推測(cè)該雜質(zhì)可能是克拉屈濱在pH偏低和有氧條件下降解產(chǎn)生。結(jié)論HPLC-Q-TOF-MS可快速鑒定克拉屈濱注射液的主要雜質(zhì),通過(guò)分析雜質(zhì)的來(lái)源,為藥品質(zhì)量控制和工藝優(yōu)化提供支持。

克拉屈濱注射液;質(zhì)譜法,高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間;鑒定,雜質(zhì);分析,雜質(zhì)來(lái)源

克拉屈濱為耐腺苷脫氨酶的脫氧腺苷類似物,為核苷類抗白血病藥,化學(xué)名為2-氯-6-氨-9-嘌呤,用于治療毛細(xì)胞白血病和Walden-Strom氏巨球蛋白血病,效果顯著,作為2-脫氧核苷類代表性藥物已列為一線藥[1]。在檢驗(yàn)克拉屈濱注射液的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在相對(duì)保留時(shí)間為0.63處有一峰面積達(dá)0.23%的雜質(zhì),人用藥物注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)(International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use,ICH)要求任何未知雜質(zhì)當(dāng)其限度超過(guò)0.1%時(shí),應(yīng)對(duì)該雜質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)確定和生物安全性驗(yàn)證[2],而國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)(試行)YBH33322005中未對(duì)其單獨(dú)進(jìn)行控制[3]。由于藥物的雜質(zhì)通常與合成工藝和藥物主成分的降解途徑有關(guān),可以對(duì)比雜質(zhì)和主成分的質(zhì)譜裂解特征來(lái)鑒定雜質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)[4],筆者在本實(shí)驗(yàn)利用高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法(high performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight-mass spectrometry,HPLC-Q-TOF-MS)的高分辨率和準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)對(duì)克拉屈濱注射液中的主要雜質(zhì)進(jìn)行確認(rèn)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC-20AD高效液相色譜儀(配DAD檢測(cè)器)及Agilent 1290高效液相色譜儀(配VWD紫外檢測(cè)器)-Agilent6538四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(美國(guó)Agilent公司)。

1.2 試藥 克拉屈濱注射液由浙江海正藥業(yè)有限公司提供(批號(hào):120101,規(guī)格:10 mL∶10 mg),甲醇為色譜純,購(gòu)自Merck公司(批號(hào):1719107349);乙酸銨(分析純,國(guó)藥化學(xué)試劑集團(tuán),批號(hào):120901);水為超純水,由Milli-Q純水儀(Milli-pore,USA,SAS67120)制得。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Grace-C18柱(250 mm× 4.6 mm,5μm),流動(dòng)相為10 mmol·L-1乙酸銨溶液-甲醇(80∶20),流速為1.0 mL·min-1,柱溫為35℃,進(jìn)樣方式為自動(dòng)進(jìn)樣,進(jìn)樣量為10μL,檢測(cè)波長(zhǎng)為265 nm[5]。

2.1.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源,正離子檢測(cè)模式,毛細(xì)管電壓4 kV,錐孔電壓65 V,噴霧氣壓0.24 MPa,干燥氣溫度320℃,裂解電壓150 V,氮?dú)庾鳛楦稍餁夂挽F化氣,分別設(shè)為10 mL·min-1和262.0 kPa。樣品從高效液相色譜儀通過(guò)T型三通閥以3∶1的分流比引入質(zhì)譜離子源內(nèi)。

2.1.3 溶液配制 精密量取克拉屈濱注射液1.0 mL,置100 m L量瓶,用甲醇-水(10∶90)稀釋制成質(zhì)量濃度為10μg·mL-1溶液,作為色譜分析的供試品溶液。取供試品溶液1.0 mL,置100 mL量瓶,用甲醇-水(10∶90)稀釋至刻度,作為有關(guān)物質(zhì)自身對(duì)照溶液,直接取克拉屈濱注射液作為質(zhì)譜分析的供試品溶液,濃度為1 mg·m L-1。

2.1.4 穩(wěn)定性影響因素考察 取克拉屈濱注射液分別考察光照、氧化、熱和pH對(duì)產(chǎn)品穩(wěn)定性的影響,在規(guī)定條件下放置后,于第5天和第10天分別取1.0 m L,置25 mL量瓶,用甲醇-水(10∶90)稀釋至刻度,按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析。

2.2 結(jié)果

2.2.1 色譜分析 參照國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)(試行)YBH33322005的HPLC條件對(duì)克拉屈濱注射液進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)時(shí),發(fā)現(xiàn)相對(duì)保留時(shí)間0.63處有一較大雜質(zhì)峰,按歸一化法計(jì)算達(dá)0.23%;另取色譜分析用供試品溶液按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣,分離效果與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)基本一致,見(jiàn)圖1。

2.2.2 質(zhì)譜分析 在ESI(+)不同能量下,克拉屈濱的二級(jí)質(zhì)譜見(jiàn)圖2,克拉屈濱雜質(zhì)的二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖3。

圖3中雜質(zhì)的[M+H]+峰m/z為170,為偶數(shù),屬于偶電子離子,應(yīng)含奇數(shù)個(gè)氮,且離子豐度[M+1]+/ [M+2]+為3∶1,說(shuō)明雜質(zhì)中含一個(gè)氯原子,克拉屈濱的二級(jí)質(zhì)譜中m/z 308為克拉屈濱的[M+Na]+峰, m/z 170是由[M+H]+中性丟失1分子2'-脫氧核苷產(chǎn)生的碎片離子1,根據(jù)質(zhì)譜裂解規(guī)律,并通過(guò)高分辨質(zhì)量數(shù)的確證(見(jiàn)表1),推斷出雜質(zhì)為克拉屈濱C-N鍵斷裂后的腺苷結(jié)構(gòu),為2-氯腺嘌呤,形成和裂解途徑見(jiàn)圖4。

圖1 克拉屈濱注射液高效液相色譜圖

圖2 克拉屈濱不同能量下的二級(jí)質(zhì)譜圖

圖3 克拉屈濱雜質(zhì)不同能量下的二級(jí)質(zhì)譜圖

圖4 克拉屈濱雜質(zhì)的形成和裂解途徑

表1 克拉屈濱及其主要雜質(zhì)的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)

2.2.3 穩(wěn)定性分析 克拉屈濱注射液在不同pH, 4 500 lx光強(qiáng),5%過(guò)氧化氫(H2O2)及60℃烘箱中放置5,10 d后的色譜分析結(jié)果見(jiàn)表2。由表2得知,克拉屈濱注射液在pH為6.5～8.0環(huán)境下最穩(wěn)定,酸性越強(qiáng),越不穩(wěn)定;克拉屈濱易氧化,而受光照和溫度的影響較小。

表2 不同環(huán)境下雜質(zhì)按歸一化法計(jì)算的百分含量

3 討論

克拉屈濱中雜質(zhì)2-氯腺嘌呤在《美國(guó)藥典》[6]和《歐洲藥典》[7]均有收載,但考慮到國(guó)內(nèi)外合成工藝可能有所不同及2-氯腺嘌呤對(duì)照品難以獲得,利用四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜高分辨率和高準(zhǔn)確度的特點(diǎn),能獲得待測(cè)物質(zhì)的準(zhǔn)確分子量,計(jì)算出可能的分子式,根據(jù)二級(jí)碎片裂解信息,結(jié)合合成工藝[8],推測(cè)出藥物雜質(zhì)的分子結(jié)構(gòu),為藥物雜質(zhì)鑒定提供一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的方法[9-10]。

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)可知,溶液酸度對(duì)克拉屈濱降解的影響較大,而現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中克拉屈濱注射液的pH范圍為5.5～7.5,建議定為更穩(wěn)定的pH范圍6.5～8.0。在氧化劑高的環(huán)境中,克拉屈濱分子中脫氧核苷與腺苷相連的C-N鍵容易斷裂,生成雜質(zhì)2-氯腺嘌呤,因此克拉屈濱注射液中雜質(zhì)2-氯腺嘌呤在原料藥得到有效控制的情況下,主要是因溶液pH偏低且有氧氣存在條件下降解產(chǎn)生,故在生產(chǎn)和儲(chǔ)存時(shí)應(yīng)特別注意溶液pH控制和容器密封,必要時(shí)充氮,避免克拉屈濱降解。

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[3] 國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)(試行)[S].2005. YBH33322005.

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DOI 10.3870/yydb.2014.06.029

R979.1;R927.2

A

1004-0781(2014)06-0794-03

2013-06-22

2013-07-20

楊麗珍(1990-),女,江西贛州人,碩士,研究方向:藥物分析與儀器分析。電話:(0)15868839451,E-mail:15807975068@163.com。

楊偉峰(1965-),男,主任藥師,碩士生導(dǎo)師,研究方向:藥物分析與儀器分析。電話:(0)13588175658,E-mail:ywfhz@163.com。