神經節(jié)苷脂-1與康復訓練對缺血缺氧性腦損傷大鼠神經功能的影響①

王珂，楊會娟，馬俊，候梅

神經節(jié)苷脂-1與康復訓練對缺血缺氧性腦損傷大鼠神經功能的影響①

王珂1，楊會娟2，馬俊1，候梅1

目的探討神經節(jié)苷脂-1(GM1)和康復訓練對大鼠缺血缺氧性腦損傷(HIBD)后功能恢復的影響及可能機制。方法48只Sprague-Dawley幼鼠建立HIBD模型，分為對照組、GM1組、康復訓練(R)組、GM1+康復訓練(GM1+R)組及假手術組。各組大鼠采用懸吊試驗、斜坡試驗和水迷宮試驗進行評定。免疫組化法檢測海馬、額葉皮質神經元活化型caspase-3表達。結果各組間懸吊試驗、斜坡試驗結果有非常高度顯著性差異(P＜0.001)，從高到低依次為假手術組、GM1+R組、R組、GM1組和對照組(P＜0.05)。各組間尋找平臺潛伏期有非常顯著性差異(P＜0.01)，對照組和GM1組較假手術組長(P＜0.05)。GM1組和R組的海馬、額葉皮質活化型caspase-3水平與假手術組有顯著性差異(P＜0.05)，GM1組、R組及GM1+R組海馬活化型caspase-3與對照組有顯著性差異(P＜0.05)，R組和GM1+R組額葉皮質活化型caspase-3與對照組有顯著性差異(P＜0.05)。海馬、額皮質活化型caspase-3的表達與懸吊試驗、斜坡試驗結果正相關(P＜0.05)，與水迷宮試驗無明顯相關(P＞0.05)。結論早期康復訓練及應用GM1對HIBD神經功能恢復有一定療效，聯(lián)合應用存在協(xié)同效應。其機制可能與神經元末梢突觸后存在大量活化型caspase-3有關。

缺血缺氧性腦損傷；神經節(jié)苷脂-1；康復；caspase-3；大鼠

[本文著錄格式]王珂，楊會娟，馬俊，等.神經節(jié)苷脂-1與康復訓練對缺血缺氧性腦損傷大鼠神經功能的影響[J].中國康復理論與實踐,2014,20(1):34-36.

缺血缺氧性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)給許多早產兒及低體重兒留下了嚴重后遺癥，包括腦性癱瘓、認知障礙、視聽障礙、癲癇等，嚴重影響患兒的生活質量，給社會和家庭帶來了沉重的負擔。神經節(jié)苷脂-1(ganglioside-1,GM1)是目前臨床較常用于治療HIBD的神經營養(yǎng)藥物，能夠保護受損神經元，促進其軸突的發(fā)芽、生長、分化等。康復訓練是改善HIBD后遺癥患兒軀體功能最主要的治療方式。caspases是半胱氨酸天冬氨酸家族的特殊蛋白酶，廣泛存在于多細胞生物，在凋亡調節(jié)時起著樞紐作用。此家族中的caspase-3常被認為是神經細胞凋亡過程中的關鍵。近來的研究發(fā)現，caspase-3也是神經生長和突觸活動的調節(jié)因子，學習和記憶的分子機制中都有caspase-3的參與。本研究從行為和分子生物學角度探討GM1和康復訓練對HIBD后功能恢復的影響及可能的機制。

1 對象與方法

1.1 對象

清潔級健康孕17 d的Sprague-Dawley大鼠8只，由青島市藥物檢測管理局實驗動物中心提供。至妊娠23 d分娩，共娩出73只幼鼠。

1.2 方法

將能夠正常進乳的48只幼鼠分入各實驗組，包括對照組11只，GM1組9只，康復訓練組(R組)13只，GM1+R組7只，假手術組8只。2日齡時，前4組予結扎左側頸總動脈的遠端及近端，假手術組只分離不結扎。

GM1組及GM1+R組4日齡起予2 mg/ml單唾液酸神經節(jié)苷脂10 ml/kg腹腔注射，其余組給予生理鹽水10 ml/kg腹腔注射，每天1次，共7 d。

R組及GM1+R組15日齡起進行康復訓練。①感覺促進訓練：用硬毛刷刷右側上下肢，沿肢體長軸方向，由近端至遠端，加壓快速刷4個8拍，每天1次。②肢體協(xié)調性及肌力訓練：大鼠睜眼后，放置于轉籠里活動，每天15 min，必要時給予夾尾刺激，使其轉籠。③游泳訓練：放置于深約30 cm的溫水槽(80×50× 55 cm)中，水面離槽口20 cm左右，用木棒驅趕大鼠在水中游泳10～15 min。共14 d。

1.3 評定方法

各組大鼠在30日齡時進行神經行為學檢測。測試前1 d，讓所有大鼠熟悉測試工具及環(huán)境30 min。測試選在暗室內進行。

1.3.1 懸吊試驗 大鼠前爪抓住一根水平拴著的自制尼龍繩(長50 cm，直徑約0.4 cm)離開桌面75 cm。記錄大鼠停留在繩上時間。評分標準：1分，＜10 s；2分，10～30 s；3分，0.5～2 min；4分，2～5 min；5分，＞5 min；當大鼠出現雙上肢沿繩橫走，或屈曲軀干試圖使下肢抓繩時，每項加0.5分。

1.3.2 斜坡試驗 將大鼠頭向下倒置于45°斜面上，記錄轉頭向上＞135°所需要的時間。

1.3.3 水迷宮試驗 記錄每只大鼠找到平臺的潛伏期。

1.3.4 活化型caspase-3檢測 行為學測試結束后，用灌流固定法處死大鼠，開顱取腦。根據大鼠立體定位圖譜，取新鮮海馬和額葉皮質組織，冠狀斷面，厚2 cm，置于10%～15%(質量濃度)甲醛中固定過夜，石蠟包埋，行連續(xù)冠狀切片，片厚4μm，脫蠟水化。以caspase-3p20(L-18)羊多克隆抗體為一抗，按照鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶(SP)免疫組化試劑盒說明操作，于光學顯微學下計數活化型caspase-3表達情況。

1.4 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行處理。各組間懸吊試驗、斜坡試驗、水迷宮試驗比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA分析)；活化型caspase-3表達因數據服從Possion分布，故對各組每100個神經元中陽性細胞(DAB染色呈棕色)數的平方根取反正弦函數，再進行單因素方差分析；活化型caspase-3的表達與懸吊試驗、斜坡試驗及水迷宮空間分辨能力測試結果的關系采用相關分析。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 懸吊試驗

各組懸吊試驗評分有非常高度顯著性差異(P＜0.001)，其中對照組最低(P＜0.05)，假手術組最高(P＜0.05)，GM1+R組高于GM1組(P＜0.05)。見表1。

2.2 斜坡試驗

各組斜坡試驗有非常高度顯著性差異(P＜0.001)，其中對照組最高(P＜0.05)，GM1+R組與假手術組無顯著性差異(P＞0.05)，其余各組均高于假手術組(P＜0.05)；GM1+R組和R組均高于GM1組(P＜0.05)。見表1。

2.3 水迷宮試驗

各組潛伏期之間有非常顯著性差異(P＜0.01)，R組和GM1+R組與假手術組間無顯著性差異(P＞0.05)，對照組和GM1組高于假手術組(P＜0.05)。見表1。

表1 各組大鼠行為學能力測試

2.4 活化型caspase-3表達

GM1組和R組的海馬、額葉皮質神經元活化型caspase-3與假手術組相比有顯著性差異(P＜0.05)，GM1+R組與假手術組比較無顯著性差異(P＞0.05)；GM1組、R組及GM1+R組的海馬活化型caspase-3與對照組有顯著性差異(P＜0.05)；R組和GM1+R組額葉皮質活化型caspase-3與對照組比較有顯著性差異(P＜0.05)，GM1組與對照組無顯著性差異(P＞0.05)。見表2。

2.5 活化型caspase-3表達與行為測試的相關性

海馬、額皮質活化型caspase-3的表達均與懸吊試驗、斜坡試驗相關(P＜0.05)，而與水迷宮試驗無明顯相關性(P＞0.05)。見表3。

表2 大鼠海馬、額葉皮質神經元活化型caspase-3表達

表3 活化型caspase-3表達與行為測試的相關性

3 討論

未成熟腦缺氧缺血性損傷是造成神經系統(tǒng)致殘性疾病的主要原因，其發(fā)病機制、預防和干預治療等方面的研究成為近年來熱點課題。2日齡大鼠的腦組織處于少突膠質細胞前體細胞的發(fā)育時期，相當于人類24～32周孕齡胎兒的發(fā)育時期[1]。此階段出生的活產兒中，腦室周圍白質軟化性病變的發(fā)生率約為2‰～4‰，且隨著出生胎齡的降低而升高[2]。

本研究采用2日齡幼鼠建立早產兒HIBD模型。研究顯示，模型大鼠的上肢肌力和隨意運動能力，以及軀體協(xié)調和平衡功能下降，與多數學者從病理學方面探討其神經功能受損的結果一致。

中樞神經系統(tǒng)具有高度可塑性(plasticity)，主要表現為突觸的形成、結構及功能的調節(jié)，即突觸形態(tài)的改變、新突觸連接的形成和傳遞功能的建立，以及由突觸的反復活動而導致的突觸傳遞效率的增加或降低[3]。中樞神經系統(tǒng)受損后，早期給予豐富環(huán)境、各種感覺運動刺激、神經營養(yǎng)因子等均能夠增強神經可塑性。

GM是組成細胞膜結構和維持膜功能的基本物質，廣泛存在于中樞神經系統(tǒng)。作為唯一可透過血腦屏障的GM，GM1通過激活神經營養(yǎng)因子受體Trk，與神經元的分化、軸突的生長及突觸的形成等密切相關，對中樞神經系統(tǒng)的發(fā)育具有重要作用。本研究顯示，GM1治療能明顯提高模型動物的肌力、隨意運動能力、軀體的平衡和協(xié)調功能。

Fang等發(fā)現，大鼠前肢感覺運動功能皮質損傷后，復雜綜合的運動技能訓練要比簡單重復的運動更能刺激大腦皮質突觸發(fā)生的增強，能更好地促進大鼠運動功能的恢復[4]。康復訓練能夠增強感覺輸入，改善神經元的微環(huán)境，分泌多種神經營養(yǎng)因子，從而促進損傷修復，誘導神經前體細胞分裂和增殖；康復訓練還能夠通過抑制細胞外Ca2+內流、鈣蛋白激酶的激活、細胞骨架的崩解，穩(wěn)定內環(huán)境，達到保護神經元免受缺血再灌注損傷，刺激和促進神經元樹突分支、軸突再生，從而引起突觸重塑、神經細胞功能的恢復與代償[5]；此外，康復訓練還可能促進缺血壞死區(qū)周圍某些保護性神經因子的分泌，以及改變中樞神經系統(tǒng)某些蛋白、基因的表達，促進軸突發(fā)芽、突觸重建等，從而有利于運動功能的恢復。

本研究顯示，康復訓練與GM1均能提高實驗動物的肌力、隨意運動功能、軀體的平衡和協(xié)調功能，以及空間分辨能力，二者聯(lián)合應用有協(xié)同作用。

既往認為，caspases在凋亡調節(jié)過程中的起著樞紐作用，caspase-3則被認為是其中的關鍵[6]。近來的研究發(fā)現，神經元內caspase-3表達并非意味著細胞凋亡，也是神經生長和突觸活動的調節(jié)因子。另外，學習和記憶的分子機制中都有caspase-3的參與[7]。本研究顯示，應用GM1和康復訓練能增加模型大鼠海馬神經元內活性caspase-3表達，對額葉內caspase-3表達，GM1干預意義較小。提示單一給予GM1干預對HIBD后功能恢復的影響較小，最好結合康復訓練。海馬、額皮質活化型caspase-3表達與動物的運動功能相關，而與空間分辨能力無明顯相關。與既往報道不盡相同。可能與本研究樣本數量、質量和實驗條件等方面的局限有關。

[1]French HM,Reid M,Mamontov P,et al.Oxidative stress disrupts oligodendrocyte maturation[J].Neurosci Res,2009,87(14):3076-3087.

[2]Volpe JJ,Kinney HC,Jensen FE,et al.The developing oligodendrocyte:key cellular target in brain injury in the premature infant[J].Dev Neurosci,2011,29(4):423-440.

[3]Small SL,Buccino G,Solodkin A.The mirror neuron system and treatment of stroke[J].Dev Psychobiol,2012,54(3):293-310.

[4]Fang PC,Barbay S,Plautz EJ,et al.Combination of NEP1-40 treatment and motor training enhances behavioral recovery after a focal cortical infarct in rats[J].Stroke,2010,41(3):544-549.

[5]Clarke J,Mala H,Windle V,et al.The effects of repeated rehabilitation "tune-ups"on functional recovery after focal ischemia in rats[J].Neurorehabil Neural Repair,2009,23(9):886-894.

[6]Blagonravov ML,Azova MM,Onufriev MV,et al.Activities of some caspase cascade enzymes and myocardial contractility in experimental left ventricular focal ischemia[J].Bull Exp Biol Med,2011,150(6): 672-675.

[7]Bravarenko NI,Onufriev MV,Stepanichev MY,et al.Caspase-like activity is essential for long-term synaptic plasticity in the terrestrial snail Helix[J].Eur J Neurosci,2006,23(1):129-140.

Effect of Ganglioside-1 and Rehabilitation on Recovery of Neurologic Behavior in Rats with Hypoxic-ischemic Brain Damage

WANG Ke,YANG Hui-juan,MA Jun,et al.Department of Neurological Rehabilitation,Qingdao Women＆Children Hospital,Qingdao 266034,Shandong,China

ObjectiveTo investigate the effects and the possible mechanism of Ganglioside-1(GM1)and rehabilitation on neurologic behaviors of rats with hypoxic-ischemic brain damage(HIBD).Methods48 immature rats developed as model of HIBD were divided into 5 groups:control group,GM1 group,rehabilitation training group(R group),GM1+R group,and sham group.They were evaluated with Climb,Slope and Water Maze Tests.The expressions of activated caspase-3 in neurons were detected with immunohistochemistry.ResultsThe achievement of Climb and Slope Test were significantly different among groups(P＜0.001),which ranked as the sham group＞GM1+R group＞R group＞GM1 group＞control group(P＜0.05).The latency of Water Maze Test was significantly different among groups(P＜0.01), which was longer in the control and GM1 groups than in the sham group(P＜0.05).The activated caspase-3 expressed in hippocampus and frontal cortex was less in the GM1 and R groups than in the sham group(P＜0.05),more in the GM1 group,R group and GM1+R group than in the control group in hippocampus(P＜0.05),more in the R group and GM1+R group than in the control group in frontal cortex(P＜0.05). The expression of activated caspase-3 in both hippocampus and frontal cortex correlated with the achievement of Climb and Slope Test(P＜0.05),but not with the latency of Water Maze Test(P＞0.05).ConclusionRehabilitation training and GM1 are effective on recovery of neural function in rats with HIBD with synergia,which may associated with the activated caspase-3 in terminal synapse.

hypoxic-ischemic brain damage;ganglioside-1;rehabilitation;caspase-3;rats

R742.3

A

1006-9771(2014)01-0034-03

2013-05-06

2013-07-08)

1.青島市婦女兒童醫(yī)院，山東青島市266034；2.莒縣人民醫(yī)院兒保科，山東莒縣276500。作者簡介：王珂(1973-)，女，山東棗莊市人，碩士研究生，主治醫(yī)師，主要研究方向：腦癱康復與癲癇診治。通訊作者：候梅。

10.3969/j.issn.1006-9771.2014.01.009