拉米夫定和阿德福韋酯抗乙型肝炎病毒耐藥位點檢測及臨床意義

賈德興，馮靜，李萍，倫秀英，于賢杰

·病毒性肝炎·

拉米夫定和阿德福韋酯抗乙型肝炎病毒耐藥位點檢測及臨床意義

賈德興，馮靜，李萍，倫秀英，于賢杰

目的對應用拉米夫定或阿德福韋酯治療后耐藥的慢性乙型肝炎患者給予聯合治療，觀察治療前后乙型肝炎病毒（HBV）變異模式的變化及對療效的影響。方法在142例對拉米夫定耐藥患者中，給予72例拉米夫定聯合阿德福韋酯、70例給予恩替卡韋聯合阿德福韋酯冶療，在72例對阿德福韋酯耐藥患者中，給予36例聯合拉米夫定、另36例聯合恩替卡韋治療，各組均治療48 w，測定和比較治療前后所有患者HBV DNA聚合酶逆轉錄區相關變異位點變化。結果在拉米夫定初治發生耐藥的患者中，發生M204V和IL180M變異率分別為98.6%（140/142）和56.3%（80/142），接受拉米夫定聯合阿德福韋酯治療患者HBV DNA陰轉率為86.1%，與恩替卡韋聯合阿德福韋酯治療患者（97.1%）比，無顯著性差異；在阿德福韋酯初治發生耐藥的患者中，A181V和N236T變異頻率分別為63.9%（46/72）和52.8%（38/72），接受阿德福韋酯聯合拉米夫定治療患者HBV DNA陰轉率為52.8%，顯著低于阿德福韋酯聯合恩替卡韋組（77.8%，P＜0.05）；在阿德福韋酯聯合拉米夫定治療的36例患者中，19例（52.8%）HBV DNA陰轉，在阿德福韋酯聯合恩替卡韋治療的36例患者中，28例（77.8%）患者HBV DNA陰轉，差異具有顯著性（x2＝4.963，P＜0.05）。結論以rtM204變異為主的拉米夫定耐藥在聯合阿德福韋酯進行挽救治療后療效確定；以rtA181變異為主的阿德福韋酯耐藥患者在接受阿德福韋酯聯合恩替卡韋治療后的療效優于聯合拉米夫定。

慢性乙型肝炎；拉米夫定；阿德福韋酯；耐藥；挽救治療

在應用核苷（酸）類藥物過程中，如發生病毒耐藥，挽救治療多采取聯合應用另一種無交叉耐藥的抗病毒藥物。我們在142例應用拉米夫定和72例應用阿德福韋酯初始治療耐藥的慢性乙型肝炎患者，檢測了治療前后其耐藥模式的變化及其對療效的影響。

1 資料與方法

1.1 病例來源自2009年9月～2012年12月我院就診或住院的慢性乙型肝炎患者214例，診斷符合2005年發布的《慢性乙型肝炎防治指南》的標準。其中142例為初次接受拉米夫定抗病毒治療發生耐藥的患者，男115例，女27例；年齡為（33.9± 12.1）歲；72例為初次接受阿德福韋酯抗病毒治療發生耐藥的患者，男52例，女20例；年齡為（43.1± 15.7）歲。

1.2 治療方法142例初次接受拉米夫定（葛蘭素史克公司）100 mg/d抗病毒治療，發生耐藥的平均時間為（42±19）w。將患者隨機分為兩組，1組給予拉米夫定聯合阿德福韋酯（葛蘭素史克公司）10 mg/d治療，另1組換用恩替卡韋（施貴寶公司）0.5 mg/d，聯合阿德福韋酯治療，共48 w；72例初次接受阿德福韋酯（葛蘭素史克公司）10 mg/d抗病毒治療，發生耐藥的平均時間為（74±21）w。將患者隨機分為兩組，1組給予阿德福韋酯聯合拉米夫定（葛蘭素史克公司）治療，另1組給予阿德福韋酯聯合恩替卡韋（施貴寶公司）治療，共48 w。

1.3 血清HBV DNA定量檢測采用熒光定量聚合酶鏈反應法檢測（美國ABI公司PE-5700熒光定量PCR擴增儀和深圳匹基公司試劑盒）。

1.4 HBV P區耐藥位點測序采用套式PCR法擴增特異性HBV基因片段（BIO-RAD系列S1000 Thermal Cycler定性PCR儀，使用上海復星公司提供的HBV DNA提取試劑盒）。采用焦磷酸測序法進行核苷酸序列測定，分析P區耐藥（PyroMark Q96 ID測序儀，PyroMark Gold Q96 Reagents焦磷酸測序試劑盒）。共檢測11個位點變異，即rtL180M、rtM204V/I、rtV173L、rtI169T、rtS202G（V/C/ I）、rtM250V（L/I）、rtA181V/T、rtN236T、rtT184A（G/I/ S/L/F）、rtA194T/M和rtI233V。

1.5 統計學方法應用SPSS13.0統計軟件，兩組間均數差異的比較采用兩獨立樣本t檢驗，計數資料采用x2檢驗及Fisher確切概率法，P＜0.05為具有顯著性差異。

2 結果

2.1 基線特征拉米夫定初治耐藥和阿德福韋酯初治耐藥患者基線資料見表1和表2。

表1 拉米夫定初治耐藥患者基線資料（±s）

表1 拉米夫定初治耐藥患者基線資料（±s）

例數年齡（歲）ALT（U/L）HBV DNA（lg copies/ml）拉米夫定聯合阿德福韋酯7233.1±12.767.1±40.55.4±0.9恩替卡韋聯合阿德福韋酯7033.5±9.873.8±57.05.3±1.0

表2 阿德福韋酯初治耐藥患者基線資料（±s）

表2 阿德福韋酯初治耐藥患者基線資料（±s）

例數年齡（歲）ALT（U/L）HBV DNA（lg copies/ml）阿德福韋酯聯合拉米夫定3642.5±18.345.8±28.04.3±0.9阿德福韋酯聯合恩替卡韋3639.7±20.150.5±31.74.3±0.7

2.2 初始治療發生耐藥后的變異模式初始應用拉米夫定耐藥后，M204V/I變異頻率為98.6%（140/142），L180M為56.3%（80/142），V173L為16.9%（24/142），A181V為2.8%（4/142），N236T為2.8%（4/142），T184G為5.6%（8/142），S202G為5.6%（8/142）。以M204V/I和M204V＋L180 M為主。存在部分恩替卡韋耐藥變異；初始應用阿德福韋酯耐藥后，A181V變異頻率為63.9%（46/72），N236T為52.8%（38/72），A181T為8.3%（6/72），L180 M為16.7（12/72），見表3。

2.3 耐藥后聯合治療的療效在治療48 w，在拉米夫定聯合阿德福韋酯治療的72例患者中，62例（86.1%）HBV DNA陰轉，在70例恩替卡韋聯合阿德福韋酯治療的患者中，68例（97.1%）HBV DNA陰轉（x2＝2.099，P＞0.05）；對所有患者再次進行P區耐藥測序。結果顯示，在兩組患者中，治療前存在M204V、M204I、M204V＋L180M＋V173L、L180 M和M204V＋V173L變異的76例患者HBV DNA均陰轉，病毒變異位點消失。在拉米夫定聯合阿德福韋酯治療的患者中，在存在M204V/L180M變異的25例患者中，5例HBV DNA未陰轉，其中4例變異模式未發生改變，另1例改變為A181T/M204V/L180 M/V173L變異。在4例M204V/L180 M/S202G變異者中，2例HBV DNA未陰轉，在4例M204V/ T184G/L180M變異者中，3例HBV DNA未陰轉，變異模式也未發生改變；在恩替卡韋聯合阿德福韋酯治療的70例患者，4例M204V/T184G/L180M變異患者中，2例HBV DNA未陰轉，其中1例改變為M204V/L180M/T184G/I/A181T變異；在治療48 w，在阿德福韋酯聯合拉米夫定治療的36例患者中，19例（52.8%）HBV DNA陰轉，在阿德福韋酯聯合恩替卡韋治療的36例患者中，28例（77.8%）患者HBV DNA陰轉，差異具有顯著性（x2＝4.963，P＜0.05）。在36例阿德福韋酯聯合拉米夫定治療的患者中，治療前9例存在A181V/N236T和A181T/ N236T變異患者HBV DNA均未陰轉，變異模式也未發生改變。在17例A181V變異患者中，有9例HBV DNA陰轉，其中1例未陰轉患者出現A181V/ M204V/L180 M變異。在36例阿德福韋酯聯合恩替卡韋治療的患者，6例存在A181V/N236T變異患者中，5例HBV DNA未陰轉，在3例A181T/N236T變異患者中，HBV DNA均未陰轉，變異模式也未發生改變。

表3 初始治療發生耐藥后的變異模式

3 討論

核苷（酸）類似物已成為繼干擾素α（IFN-α）之后的又一類用于抗HBV治療的有效藥物。大多數接受核苷（酸）類似物治療的患者難以通過短期治療實現持久應答，而需要接受長期治療，這必將增加病毒耐藥的風險。隨著核苷（酸）類似物種類的增加，HBV耐藥變異的復雜性也大大增加。HBV侵入人體后，與靶細胞膜上的受體結合，脫去包膜，進入細胞質中，脫去核衣殼，部分雙鏈環狀HBV DNA進入靶細胞核中，在DNA聚合酶作用下，以負鏈DNA為模板，延長正鏈，修補裂隙區，形成共價閉合環狀DNA（cccDNA）。HBV DNA的復制首先以cccDNA為模板，在宿主RNA聚合酶的作用下，轉錄成3.5kb、2.4kb、2.1kb和0.7kb等大小不同的HBV mRNA，部分3.5kb的HBV mRNA作為前基因組RNA，在HBV逆轉錄酶的作用下，逆轉錄為負鏈DNA，再以此為模板，在HBV聚合酶的作用下合成正鏈DNA，形成子代病毒的部分雙鏈HBV DNA。其他的HBV mRNA在細胞漿中翻譯成病毒的各種蛋白成分，并與子代HBV DNA裝配成完整的病毒顆粒，釋放至細胞外。部分子代HBV DNA進入靶細胞核中，補充cccDNA池，并繼續復制，周而復始。慢性HBV感染者肝細胞核中的cccDNA半壽期長，而現有核苷（酸）類似物對于cccDNA均無直接作用，這也是多數患者需用核苷（酸）類似物長期治療的原因之一。

HBV每24 h可復制1×1012～1013拷貝。HBV雖然屬于DNA病毒，但其復制過程并非DNA-DNA的直接復制過程，而是經過前基因組RNA的中間過程，即DNA-RNA-DNA的復制過程。在前基因組RNA逆轉錄為負鏈DNA的過程中，由于HBV逆轉錄酶缺乏嚴格的校正機制，導致HBV復制過程中核苷酸錯配率較高，介于其他DNA病毒和RNA病毒之間，大約為1/105。HBV復制的這種過程和特點，決定了同一患者體內不同的HBV株基因序列之間也存在差別，因此，每一個患者體內的病毒都是由存在基因序列差異的病毒株組成的動態變化的病毒群，即HBV以準種（quasispecies）的形式存在。

HBV病毒群的演變也符合達爾文進化論的規律。有些位點的變異，可能是致死性的，發生這種變異的HBV不能存活。有些位點的變異對其復制能力沒有顯著影響，但很多位點變異導致子代病毒復制能力降低或增強。不同基因序列的病毒株在病毒群中所占的相對比例，一方面取決于病毒株自身的復制能力，另一方面也受到機體免疫系統或藥物的選擇性壓力的影響。

核苷（酸）類似物進入機體后，形成三磷酸活性成分，與機體天然的脫氧三磷酸核苷（dNTP）競爭性結合到HBV聚合酶上。但由于三磷酸化的核苷（酸）類似物不具備天然的dNTP結構，而使HBV的DNA鏈合成終止，從而抑制HBV復制。但如果患者體內的HBV序列發生變異，導致產生的HBV聚合酶與核苷（酸）類似物結合力降低，那么變異的HBV即不受核苷（酸）類似物的抑制或抑制能力下降。因此，在繼續應用核苷類似物治療的情況下，野生株病毒因對核苷（酸）類似物敏感而繼續被抑制；變異株病毒因具備一定的復制能力，而且對核苷（酸）類似物不敏感而逐漸替代野生株，成為體內HBV的優勢株，從而導致患者對于核苷（酸）類似物的耐藥。

核苷類藥物的耐藥及管理是慢性乙型肝炎診治中十分重要的問題。一旦發生耐藥，導致疾病進展（如病毒學反彈、生化學突破、肝炎復燃、肝臟失代償甚至肝衰竭），耐藥患者肝硬化和肝癌發生率增高，耐藥可使已取得的組織學改善逆轉，耐藥病毒株的傳播可能導致公共衛生問題，耐藥突變可導致S基因突變，產生免疫逃逸株，既能感染未接種乙肝疫苗者，也可感染已接種乙肝疫苗者，耐藥使后續治療方案變得更為復雜和困難；耐藥將增加長期治療的醫療成本。近年來，我國、亞太、歐洲和美國肝病學會對慢性乙型肝炎診療指南及共識不斷地更新[1～6]，指導臨床醫生進行有效的耐藥管理，以期達到降低疾病進展風險、改善預后、降低治療成本的目的。

拉米夫定應用廣泛，但其耐藥率高。對于初治的慢性乙型肝炎患者，拉米夫定1～5年耐藥率可由14%升至70%[7～9]。拉米夫定耐藥的主要變異位點為HBV聚合酶區rtM204V/I/S，并可伴有L180M、V173L等位點的代償變異[10，11]。也有報道拉米夫定耐藥后篩選出對其它核苷類藥物的耐藥變異[12，13]。針對拉米夫定耐藥曾一度選擇序貫阿德福韋酯或恩替卡韋挽救治療，但此后發現序貫治療增加了多重耐藥的發生[14，15]。本研究發現在未應用阿德福韋酯之前，在拉米夫定耐藥患者中已出現拉米夫定與恩替卡韋的雙重耐藥變異，變異模式為M204V＋L180 M＋S202G、M204V＋T184G＋L180M。給予耐藥患者聯合阿德福韋酯或換用恩替卡韋聯合阿德福韋酯治療48周后，2組患者HBV DNA陰轉率無顯著性差異。但值得注意的是，在拉米夫定聯合阿德福韋酯組中，不應答的患者出現對拉米夫定及阿德福韋酯的雙重耐藥，而在恩替卡韋聯合阿德福韋酯組中，不應答的患者出現對拉米夫定、阿德福韋酯及恩替卡韋的多重耐藥。阿德福韋酯耐藥的主要變異位點為rtA181V/T和rtN236T，而rt181位點突變較rt236多見。

體外實驗表明，rtA181V/T變異對拉米夫定敏感性下降，對阿德福韋酯敏感性也顯著下降；rtA181V+rtN236T對拉米夫定敏感性下降35～43倍，對阿德福韋酯敏感性下降18倍[16，17]；而單一rtN236T變異對拉米夫定敏感，對阿德福韋酯敏感性顯著下降[18]。2009年歐洲肝病學會CHB診療指南提示，rtA181耐藥株對恩替卡韋和替比夫定敏感[19]。韓國學者Cho et al報道，對阿德福韋酯耐藥的慢性乙型肝炎患者存在rtA181V/T突變，應用阿德福韋酯聯合恩替卡韋治療，治療12個月時病毒學應答率為95.8%[20]。國內也有研究證實應用阿德福韋酯出現rtA181耐藥時加用或換用恩替卡韋的療效好于加用替比夫定[21]。我們對初始阿德福韋酯治療發生耐藥的患者給予聯合恩替卡韋或聯合拉米夫定治療，發現聯合恩替卡韋的療效的確優于聯合拉米夫定，未發現不應答的患者出現廣泛的耐藥位點。

目前，在我國慢性乙型肝炎初治的患者中，應用核苷類藥物抗病毒治療仍以低效、高耐藥的藥物為主，因可出現不應答，被迫挽救治療，聯合或序貫應用多種核苷類藥物，可出現針對多種藥物的耐藥突變。如何盡可能地避免多重耐藥的發生，我們認為對服用核苷類藥物出現耐藥的患者，應盡可能檢測所有相關的變異位點，而不應局限于已服用藥物的變異位點。根據檢測結果調整治療方案以提高療效。以rtM204變異為主的拉米夫定耐藥，聯合阿德福韋酯進行挽救治療療效確定，如換用恩替卡韋聯合阿德福韋酯，未能增加療效，且產生更為復雜而難以處理的耐藥模式。以rtA181變異為主的阿德福韋酯耐藥，聯合恩替卡韋的療效優于聯合拉米夫定。我們未在阿德福韋酯耐藥聯合恩替卡韋治療的患者中發現更廣泛的耐藥位點，是否與觀察時間不是足夠長（僅48周）有關，有待在以后的工作中進一步觀察。

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（收稿：2013-11-18）

（校對：陳從新）

Rescued antivira ltherapy of patients with hepatitis B virus rtM204/rtA181 mutants resistant to lamivudine or adefovir

JiaDexing，FengJing，LiPing，etal.DepartmentofInfectiousDiseases，People’s Hospital，Weifang 261041，Shandong Province，China

ObjectiveTo evaluate hepatitis B virus（HBV）mutations and its impact on antiviral effects in chronic hepatitis B（CHB）patients with mutants resistant to lamivudine or adefovir.Methods142 nucleos（t）idenaive CHB patients treated with lamivudine were switched to lamivudine plus adefovir（n=72）or entecavir plus adefovir（n=70）because of lamivudine resistance and 72 nucleos（t）ide-naive CHB patients treated with adefovir were switched to adefovir plus lamivudine（n=36）or adefovir plus entecavir（n=36）after resistance occurred. HBV DNA polymerase reverse transcriptase mutations were analyzed before and after 48 weeks of rescue therapy. ResultsAmong CHB patients with lamivudine resistance，mutation patterns were mainly M204V and IL180M，with a frequency of 98.6%（140/142）and 56.3%（80/142），respectively；Undetectable serum HBV DNA were noted in 86.1%of patients in lamivudine and adefovir treatment group，and 97.1%of patients in entecavir and adefovir treatment group（P＞0.05）；Among CHB patients with adefovir resistance，A181V and N236T mutation rates were 63.9%（46/72）and 52.8%（38/72），respectively；Undetectable serum HBV DNA were found in 52.8%（19/36）of patients in adefovir and lamivudine treatment group，significantly lower than that[77.8%（28/36），x2＝4.963，P＜0.05]of patients in adefovir and entecavir treatment group.ConclusionsAddition of adefovir dipivoxil to lamivudine is effective rescue therapy in patients with rtM204 mutation resistance to lamivudine，but in patients with rtA181 mutation resistance to adefovir dipivoxil，the addition of entecavir is superior to lamivudine.

Hepatitis B；Lamivudine；Adefovir；Drug resistance；Rescue therapy

261041山東省濰坊市人民醫院感染性疾病科

賈德興，男，52歲，主任醫師。主要從事感染性疾病診斷與治療學研究。E-mail:jiadexing@medmail.com.cn

馮靜，E-mail:fengjing201001@aliyun.com

10.3969/j.issn.1672-5069.2014.05.013