Rac1對L02肝細胞株上皮細胞間質轉化及增殖和凋亡的影響*

王暉暉，張峰，沈珊珊，諸葛宇征

·實驗性肝炎·

Rac1對L02肝細胞株上皮細胞間質轉化及增殖和凋亡的影響*

王暉暉，張峰，沈珊珊，諸葛宇征

目的檢測Rac1在TGF-β1誘導的L02細胞上皮間質轉化中的作用，及其對細胞增殖和凋亡的影響。方法應用不同活性的Rac1質粒pExRed-NLS Flag（空載體組）、pExRed-NLS Flag Rac1（野生型Rac1組）、pExRed-NLS Flag Rac1T17N（顯性負調控Rac1組）、pExRed-NLS Flag Rac1G12V（持續活化型Rac1組）瞬時轉染L02細胞，經5 ng/ml TGF-β1處理細胞。采用免疫印跡法檢測融合蛋白Flag-Rac1表達，采用細胞免疫熒光及免疫印跡法檢測Ck8和Vimentin表達，采用細胞劃痕實驗及Transwell法檢測細胞遷移能力。使用不同濃度的Rac1特異性抑制劑NSC23766處理L02細胞，采用CCK-8法檢測細胞增殖，采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡。結果四組質粒均成功瞬時轉染到L02細胞中；與空載體組和野生型Rac1組比，持續活化型Rac1轉染細胞Vimentin蛋白表達水平顯著增高，CK8蛋白表達水平降低，細胞遷移能力增加；與空載體組和野生型Rac1組比，顯性負調控Rac1轉染細胞Vimentin蛋白表達水平降低，CK8蛋白表達水平增高，細胞遷移能力降低（P＜0.05）；在NSC23766處理L02細胞后，細胞增殖被抑制，但各處理組細胞凋亡無明顯差異。結論Rac1可促進TGF-β1誘導的L02肝細胞株上皮間質轉化和細胞增殖，但對細胞凋亡無明顯影響。

L02細胞；Rac1；上皮間質轉化；增殖；凋亡

上皮細胞間質轉化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）是指具有極性的上皮細胞轉化成具有活動能力、能夠在細胞基質間自由移動的間質細胞，以上皮細胞極性的喪失和間質特性的獲得為重要特征[1]。近年來，已有研究發現肝上皮細胞可通過EMT參與細胞外基質的合成與分泌[2]。Ras相關C3肉毒素底物1（Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，Rac1）是小G蛋白超家族的成員之一，于1989年首次被發現[3]。眾多研究顯示Rac1在多種細胞內具有調節肌動蛋白細胞骨架重組，導致細胞板狀偽足形成和膜褶皺樣運動，促進細胞運動與遷移，抑制細胞凋亡等作用[4]。Bakin et al[5]證實Rac1通過抑制轉化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）誘導鼠乳腺上皮細胞（NmuMG）中p38MAPK及其下游底物ATF2的磷酸化，進而抑制TGF-β1誘導的EMT。TGF-β1在誘導肝細胞EMT中也起到關鍵的作用[6]。但是，Rac1在EMT中的作用尚不清楚。本文將通過轉染不同活性的Rac1質粒到人肝上皮細胞株L02中，觀察其對TGF-β1誘導的EMT的作用，同時研究Rac1對L02細胞增殖和凋亡的影響，以進一步探討Rac1在肝纖維化的發生和發展中的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑人肝細胞株L02細胞為南京市鼓樓醫院消化科實驗室保存;四種質粒pExRed-NLS Flag（空載體）、pExRed-NLS Flag Rac1（野生型）、pExRed-NLS Flag Rac1T17N（顯性負調控）和pExRed-NLS Flag Rac1G12V（持續活化型）由日本心腦血管研究中心Nao Mochizuki教授惠贈，RPMI 1640培養基、胎牛血清購于維森特生物技術（南京）有限公司；胰酶購于美國Gibco公司；CCK-8試劑盒購于日本同仁化學研究所；抗Rac1小鼠源性單克隆抗體購于英國Abcam公司，抗波形蛋白（Vimentin）鼠源性抗體購于德國Merck&Millipore公司;抗角蛋白-8（Cytokeratin-8，CK-8）兔源性抗體購于Bioworld公司；GAPDH購于美國Epitomics公司；辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠或抗兔IgG購自杭州聯科生物公司；TGF-β1購自美國Peprotech公司，FITC標志的羊抗兔IgG和Lipofectamine2000購于美國Invitrogen公司；Transwell小室購自美國Corning公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購于圣地亞哥eBioscience公司；NSC23766購于美國Tocris bioscience公司。

1.2 細胞培養取人L02細胞，培養于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基中（37℃、5%CO2），待細胞融合至90%左右，用0.25%胰酶-EDTA消化、傳代。

1.3 細胞轉染及TGF-β1預處理將對數生長期的L02細胞以每孔2×105個細胞接種于6孔細胞培養板，37℃培養過夜。根據Lipofectamine2000說明書操作步驟，將四種質粒分別轉入細胞內，轉染4～6 h，換成正常培養基，并用5 ng/ml TGF-β1處理48 h。

1.4 細胞融合蛋白的檢測采用Western blotting法，取經過預處理的細胞，加PBS洗滌，加入RIPA裂解液冰上裂解30 min，30 min后4℃、12000 r/m離心10 min，取上清液于-20℃保存。各組蛋白等量加樣，10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，200 mA恒流轉至PDVF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入一抗（小鼠抗人Rac1 1:5000，兔抗人GAPDH 1:5000，小鼠抗人Vimentin 1:5000，兔抗人CK8 1:5000），室溫孵育過夜，TBST洗滌3次，加HRP標記的羊抗兔或鼠（1:5000）二抗，室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，每次10 min，加ECL發光液化學發光顯色，手動壓片曝光，并用Quantity one 4.4定量分析，以目的蛋白與內參GAPDH的比值作為目的蛋白的相對表達量。

1.5 細胞Vimentin和CK8檢測采用免疫熒光法，取預處理細胞，加4%多聚甲醛固定15 min，加10%山羊血清封閉1 h，加小鼠抗人Vimentin單克隆抗體（1:200），兔抗人CK8單克隆抗體（1:200），4℃過夜，加FITC標記的羊抗兔IgG（1:200）室溫下孵育1 h，用2 μg/ml DAPI避光孵育5 min，染核。于熒光顯微鏡下拍照，并分析各組細胞的熒光強度。

1.6 細胞遷移能力檢測采用細胞劃痕實驗法，轉染細胞4～6 h，以無菌移液管尖在培養板單層細胞的相同位置劃直線，PBS洗去脫落細胞，加5 ng/ml的TGF-β1處理24 h，顯微鏡下觀察細胞從劃痕處向中央爬行的距離，每孔隨機選取6個視野觀察并拍攝，行3次獨立實驗取均值；另采用Transwell小室實驗，轉染細胞4～6 h，胰酶消化，調整各組細胞使其細胞數為1×104/ml。取各組細胞200 μl，加入各小室，下室加入500 μl的10%FBS-RPMI 1640培養基，并按5 ng/ml的質量濃度加入TGF-β1，常規培養24 h，取出，加PBS洗滌，4%多聚甲醛固定，結晶紫染色，光鏡下隨機選取6個視野，拍照、計數，取平均值。

1.7 細胞增殖的檢測采用CCK-8法，取對數生長期的L02細胞，以2×104/孔接種于96孔板，過夜貼壁培養，加入質量濃度分別為25μmo/L、50μmo/L、100μmo/L和200μmo/L的Rac1特異性抑制劑NSC23766，分別處理0 h、24 h、48 h和72h。每組加入CCK-8溶液10μl/孔，37℃培養箱孵育1 h，以酶標儀測定450 nm波長處吸光度值。

1.8 細胞凋亡的檢測采用Annexin V-FITC/PI雙染法，加不同濃度的NSC23766（25μmo/L、50μmo/L、100μmo/L和200μmo/L）干預L02細胞48 h，按照Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書處理，上流式細胞儀（BD FACSAria II）檢測。1.9統計學處理應用SPSS18.0軟件進行數據統計，計量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 質粒轉染情況在質粒轉染后，采用Western blotting法檢測融合蛋白Flag-Rac1的表達，結果與空質粒組比，野生型Rac1組、顯性負調控Rac1組和持續活化型Rac1組在瞬時轉染后，可見融合蛋白的表達（圖1）。

圖1 質粒轉染L02細胞融合蛋白的表達1：pExRed-NLS Flag；2：pExRed-NLS Flag Rac1；3：pExRed-NLS Flag Rac1T17N；4：pExRed-NLS Flag Rac1G12V（持續活化型Rac1組）

2.2 Rac1促進間質Vimentin表達，抑制上皮CK8表達四組細胞在瞬時轉染后，與空質粒組和野生型Rac1組比，持續激活型Rac1轉染細胞CK8表達減少，Vimentin表達增加，而顯性負調控Rac1轉染細胞CK8表達增加，Vimentin表達減少（圖2）；持續激活型Rac1轉染細胞較空質粒或野生型Rac1轉染細胞CK8表達減少，Vimentin表達增加，而顯性負調控Rac1轉染細胞CK8表達增加，Vimentin表達減少，以上差異具有統計學意義（P均＜0.05，圖3）。

2.3 Rac1促進L02細胞遷移與空質粒或野生型Rac1轉染細胞比，持續激活型Rac1轉染細胞劃痕愈合效率較高，而顯性負調控Rac1轉染細胞則相對較低（P均＜0.05，圖4）；與空質粒或野生型Rac1轉染細胞比，持續激活型Rac1轉染的L02細胞遷移能力增加，而顯性負調控Rac1轉染的L02細胞遷移能力減弱（P均＜0.05，圖4）。

圖2 各組細胞Vimentin和CK8的表達情況（免疫熒光染色，400×）

圖3 各組細胞Vimentin和CK8的表達情況（Western blotting法）

圖4 各組細胞遷移能力的變化細胞劃痕實驗和Transwell法檢測

2.4 Rac1促進L02細胞增殖與對照組比，除了25 μmo/L處理組的細胞外，其他處理組的L02細胞在48 h和72 h時的細胞增殖率均降低，且呈濃度依賴性（圖5）。

圖5 NSC23766對細胞增殖的影響

2.5 Rac1對L02細胞凋亡無影響與對照組比，各處理組L02細胞凋亡的差異無統計學意義（P＞0.05，圖6）。

圖6 NSC23766對細胞凋亡的影響

3 討論

在誘導EMT發生的眾多細胞因子和轉錄因子中，TGF-β1是關鍵因子之一。TGF-β1首先被發現在正常乳腺上皮細胞中可誘導EMT的發生[4]，之后又被證明其能在體外調控多種不同的上皮細胞發生EMT，包括角質形成細胞、氣道上皮細胞和肝細胞等[6，8]。Kojima et al[9]研究發現TGF-β1通過下調Claudin-1，同時上調SIP1和Snail誘導大鼠肝細胞EMT。Kaimori et al[10]進行體外實驗發現，組蛋白脫乙酰酶可抑制TFG-β1誘導肝細胞EMT的發生。

已有研究表明Rac1可通過不同機制參與多種上皮細胞的EMT過程，Rac1可協同PI3K、JNK信號通路，在I型膠原誘導的鼠乳腺上皮細胞的EMT過程中發揮調控作用。Santibanez et al發現表達持續活化型Rac1（Q61LRac1）可促進角質形成細胞發生EMT，同時細胞運動及侵襲能力增強。相反，表達顯性負調控型Rac1（N17TRac1）將抑制TGF-β1誘導的細胞伸展、運動和遷移。然而，在TGF-β1誘導的肝上皮細胞EMT中Rac1的作用并不明確。

本實驗通過將不同Rac1活性的質粒轉染到肝上皮細胞中，經TGF-β1誘導后，證實Rac1通過以下兩個方面影響L02細胞EMT：（1）細胞出現EMT分子標志物的改變，即上皮標志物CK8表達下調、間質標志物Vimentin表達上調；（2）細胞劃痕實驗和Tranwell小室實驗均證實細胞遷移能力增強。

既往研究主要集中在Rac1對細胞運動等的影響，而并無Rac1對肝上皮細胞的增殖和凋亡影響的報道。本實驗中采用的特異性Rac1抑制劑NSC23766是一種具有膜通透性的復合物，能特異性地阻斷Rac1與Rac1特異性的GEFs Trio和Tiam1結合而影響Rac1 GDP/GTP的循環，從而抑制Rac1的活性。本研究用CCK-8法檢測了不同濃度Rac1抑制劑NSC23766對L02增殖水平的影響，結果顯示L02細胞增殖被抑制的程度隨著抑制劑濃度的增加而增加，即抑制Rac1的活性可抑制L02細胞增殖，與Bosco et al的研究結果相吻合，即在抑制Rac1活性后，經典Wnt通路受抑制，從而逆轉了缺乏NF2細胞的細胞增殖。本實驗結果顯示，采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡，發現不同濃度的NSC23766對L02細胞凋亡無明顯的影響。

本研究通過將上調和下調Rac1活性的質粒轉染到L02細胞，初步證實Rac1可促進TGF-β1誘導的肝上皮細胞EMT；通過Rac1抑制劑處理L02細胞，觀察到Rac1可促進L02細胞增殖，而對其凋亡無明顯影響；這些現象的發生機制仍然有待進一步探討。

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（收稿：2014-02-07）

（校對：陳從新）

Effects of Rac1 on epithelial-mesenchymal transition，and proliferation and apoptosis of L02 cells in vitro

Wang Huihui，Zhang Feng，Shen Shanshan，et al.School of Medicine，Southeast University，Nanjing，210009，Jiangsu Province，China

ObjectiveTo investigate the effects of Rac1 on epithelial mesenchymal transition（EMT）induced by transforming growth factor β1（TGF-β1），and on cell proliferation and apoptosis of L02 cells in vitro. MethodsRac1 plasmids with different activity including pExRed-NLS Flag（vector），pExRed-NLS Flag Rac1（wild type），pExRed-NLS Flag Rac1T17N（dominant negative mutant）and pExRed-NLS Flag Rac1G12V（constitutively active mutant）were transiently transfected into L02 cells，followed by stimulation of exogenous TGF-β1 at dose of 5ng/ml；Exogenous Flag-Rac1 fusion protein was determined by Western blot analysis；Immunofluorescence and Western blot were used to evaluate epithelial markers of Ck8 and mesenchymal markers of vimentin；Cell motility was assessed by transwell assay and wound healing assay；L02 cells were treated with different concentrations of Rac1 inhibitor（NSC23766），and the influence of Rac1 on cell proliferation and apoptosis were detected by CCK-8 assay or Annexin V-FITC/PI double staining，respectively.ResultAll kinds of plasmids were successfully transiently transfected into L02 cells；Compared with the vector group and the wild type group，constitutively active mutant pExRed-NLS Flag Rac1G12V significantly increased the expression of vimentin，decreased the expression of CK8 and enhanced cell motility，whereas the effects of dominant negative mutant pExRed-NLS Flag Rac1T17N were just the opposite of above results（P＜0.05）；Disruption of Rac1 activity with NSC23766 inhibited cell proliferation（P＜0.05）without increasing cell apoptosis.ConclusionsRac1 promotes the EMT process and cell proliferation induced by TGF-β1 in L02 cells without affecting cell apoptosis in vitro.

L02 cells；Rac1；Epithelial-mesenchymal transition；Proliferation；Apoptosis

10.3969/j.issn.1672-5069.2014.05.019

江蘇省自然科學基金資助項目（BK2011094）

210009南京市東南大學醫學院（王暉暉）；南京大學醫學院附屬鼓樓醫院消化科(張峰,沈珊珊，諸葛宇征)

王暉暉，女，24歲，碩士研究生。E-mail: wanghuihui19891021@163.com

諸葛宇征，E-mail：yuzheng9111963@aliyun.com