吡格列酮對高糖培養大鼠腎小球系膜細胞p38絲裂原活化蛋白激酶和轉化生長因子β-1的影響

汪姍，葉山東，孫文佳，胡圓圓

（安徽醫科大學附屬省立醫院、安徽省立醫院內分泌科，合肥 230001）

吡格列酮對高糖培養大鼠腎小球系膜細胞p38絲裂原活化蛋白激酶和轉化生長因子β-1的影響

汪姍，葉山東，孫文佳，胡圓圓

（安徽醫科大學附屬省立醫院、安徽省立醫院內分泌科，合肥 230001）

目的觀察吡格列酮（PIO）對高糖（HG）培養的腎小球系膜細胞（MCs）p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）和轉化生長因子β-1（TGF-β1）表達的影響，探討PIO腎保護作用及機制。方法體外培養MCs，取對數生長期的細胞以2×105／孔的密度接種于6孔細胞培養板，同步化后隨機分為正常對照（NG）組、HG組、p38MAPK抑制劑（S）組及PIO（P）組。Western blot測定磷酸化p38MAPK（p-p38）和總p38MAPK（t-p38）蛋白含量，半定量RT-PCR測定細胞TGF-β1 mRNA表達情況。結果與NG組比較，HG組細胞內p-p38MAPK含量和TGF-β1mRNA表達增強（P＜0.01）；與HG組比較，p38MAPK抑制劑顯著抑制HG刺激的細胞內p38MAPK活性和TGF-β1表達（P＜0.05）；與HG組比較，P組細胞內上述變化亦明顯降低（P＜0.05），與S組相似；p38MAPK活性和TGF-β1表達呈正相關（r＝0.587，P＜0.01）。結論PIO可抑制腎小球系膜p38MAPK通路，降低TGF-β1表達，該作用可能與其腎臟保護部分有關。

糖尿病腎病；腎小球系膜細胞；P38絲裂原活化蛋白激酶類；轉化生長因子β1；噻唑烷二酮類

圖1 各組P-P38MAPK、t-P38MAPK表達結果

圖2 各組MCs TGF-β1 mRNA相對表達量

圖3 大鼠腎小球MCs P38MAPK蛋白表達量與TGFβ-1mRNA表達量的相關性分析

糖尿病腎病（DN）是糖尿病重要的微血管并發癥，其發病機制復雜，尚未明確。研究顯示p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）是糖尿病多種致病因素共同信號通路的交匯點［1］。轉化生長因子β-1（TGF-β1）是一重要的細胞因子，對細胞的生長、分化和免疫功能都有重要的調節作用，并通過多種機制參與糖尿病腎小球硬化的發生。PPARγ激動劑吡格列酮（PIO）是一類廣泛使用的抗糖尿病藥物，近來研究顯示其尚具有降糖之外的腎臟保護作用［2-3］，是否涉及p38MAPK信號通路介導TGF-β1表達，尚未明確。本研究擬通過體外培養大鼠腎小球系膜細胞（MCs），比較觀察PIO和p38MAPK抑制劑（SB203580）對HG培養下的MCs p38MAPK和TGF-β1的影響，探討其可能的腎保護機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞來源 MCs購自中國典型培養物保藏中心。

1.1.2 主要藥物及試劑 DMEM培養液購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；PIO由江蘇恒瑞醫藥公司惠贈；SB203580P、預染Marker購自美國Sigma公司；全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠試劑盒和ECL檢測液購自碧云天生物有限公司；抗鼠p38MAPK多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；抗鼠p-p38MAPK單克隆抗體購自美國Cell Signaling公司；β-actin抗體購自上海生工生物工程有限公司；辣根酶標記羊抗兔IgG購自北京中杉公司；DMSO、Trizol購自美國Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒及PCR試劑購自大連寶生物公司；PCR所用引物由大連寶生物有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及分組 MCs常規培養于含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM液中（Glu 5.6 mol／L），37℃，5%CO2。取對數生長期的細胞以2× 105／孔的密度接種于6孔細胞培養板，同步化后按下列分組進行處理：①正常對照組（NG組）：DMEM細胞培養液（Glu 5.6 mmol／L）；②HG組：DMEM細胞培養液（Glu 25 mmol／L）；③p38MAPK抑制劑組（S組）：HG＋SB203580（10μmol／L）；④PIO（P）組：HG＋PIO（10-6mmol／L）。SB203580預先刺激3 h，PIO預先干預24 h。以上各組標本培養48 h后，分別收集細胞和培養上清液，每組重復4次。

1.2.2 Western blotting檢測腎組織磷酸化p38MAPK（p-p38）和總p38MAPK（t-p38）的表達分別收集細胞提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度。10%SDS-PAGE凝膠電泳，電轉膜（PVDF膜），脫脂奶粉封閉，一抗p-p38MAPK（1∶1 000）、t-p38MAPK（1∶1 000）、β-actin（1∶1 000）4℃過夜，洗膜，二抗（1∶5 000）孵育，ECL化學發光，X膠片顯影，Quantity One分析光密度值。

1.2.3 RT-PCR檢測MCs TGFβ-1 mRNA表達TRIzol法提取細胞總RNA，逆轉錄成cDNA，操作遵試劑說明。TGFβ-1引物序列為上游5＇-CTT CAG CTC CAC AGA GAA GAA CTG C-3＇，下游5＇-CAC GATCATGTTGGA CAA CTG CTCC-3＇，目標片段大小為298 bp。以GAPDH為內參照，上游5＇-CTC TAC CCA CGG CAA GTTCAA-3’，下游5＇-GGA TGA CCT TGC CCA AGC-3＇，目標片段515 bp。反應條件均為94℃預變性3 min后，進入94℃30 s變性、52℃60 s退火、72℃60 s延伸的熱循環，循環35次，終末延伸72℃10min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳后拍照，進行光密度掃描，以TGFβ-1／GAPDH條帶光密度比值表示TGFβ-1 mRNA的相對表達量。

1.3 統計學處理 應用SPSS17.0軟件進行統計學處理，計量資料以±s表示。采用單因素方差分析比較各組間差異，采用SNK檢驗進行組間兩兩比較，相關性分析采用Pearson相關分析。

2 結果

2.1 PIO和SB203580對HG培養的MCs p38MAPK磷酸化程度的影響 HG組p-p38MAPK水平為NG組的1.93倍（0.88±0.09比0.46±0.07，P＜0.01）。SB203580和PIO可顯著抑制HG介導的p38MAPK活化，分別為S組（0.57±0.06，P＜0.01）、P組（0.60±0.03，P＜0.01），S組與NG組（P＜0.05）、P組與NG組之間有差異（P＜0.05），P組與S組差異無統計學意義。各組間t-p38MAPK表達則無明顯變化，分別為（0.98±0.04，1.00± 0.03，1.00±0.06，0.99±0.05），見圖1。

2.2 PIO和SB203580對HG刺激下腎小球MCs TGFβ-1 mRNA的表達 MCs經HG處理后TGFβ-1表達量較NG組明顯增加（1.01±0.15vs 1.54± 0.16，P＜0.01）。PIO和SB203580均可顯著降低HG誘導的TGFβ-1高表達，分別為P組（1.30± 0.15，P＜0.05）、S組（1.18±0.12，P＜0.01），P組與S組、S組與NG組之間差異無統計學意義，見圖2。2.3 相關性分析 根據Pearson相關分析，MCs內p38MAPK活性與TGFβ-1表達呈高度正相關（r＝0.719，P＜0.01），見圖3。

3 討論

DN的主要病理特點是MCs增殖、肥大以及細胞外基質過度積聚。p38MAPK作為細胞內的一類絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，可通過增加核轉錄因子cAMP-反應結合蛋白（CREB）、轉錄激活蛋白-1（AP-1）水平，上調轉化生長因子β1（TGF-β1）、核因子-κB（NF-κB）、纖維粘連蛋白（FN）的表達，參與炎癥、應激、細胞周期和凋亡等病理生理過程，加劇腎臟進行性纖維化［1］。Sakai等［4］研究表明p38MAPK在糖尿病患者腎小管間質中的表達與腎小管的損害呈正相關，阻斷p38MAPK通路有助于DN的預防和治療。TGF-β1被認為是腎小球硬化和腎小管間質纖維化機制中最關鍵的細胞因子，在DN相關生長因子網絡中處于中心地位［5］。研究揭示［6］MAPK通路可介導TGF-β1誘生的系膜區基質沉積。另一方面TGF-β1又可以活化p38MAPK，增加FN表達，且可被p38MAPK抑制劑阻斷［7］。我們實驗結果顯示HG刺激后，MCs p38MAPK磷酸化水平和TGF-β1 mRNA表達明顯增加，且兩者高度相關，給予p38MAPK特異性抑制劑后，TGF-β1 mRNA表達明顯減輕，提示p38MAPK在MCsTGF-β1的表達中起重要的介導作用，與文獻一致［8］。

研究證實PIO對腎臟具有保護作用，但有關其作用機制尚未明確［3，9-10］。Ji等［11］在對小神經膠質細胞的研究中發現，PIO可抑制P38MAPK活化，降低脂多糖誘導的iNOS的表達和NO的生成，調節炎癥過程而發揮對神經細胞的保護作用。本實驗研究發現，預先給予PIO干預后，HG誘導的MCs p38MAPK磷酸化水平降低，其作用與p38MAPK特異性抑制劑SB203580作用類似，提示PIO可抑制p38MAPK的過度活化，該作用可能與其上調PPAR-γ表達，拮抗p38MAPK有關［12］。有關兩者拮抗的具體機制尚不清楚，Adams等［13］認為兩者均可競爭PPAR-γ激活因子或磷酸化的Ser82。進一步觀察顯示PIO可抑制MCs TGF-β1表達，其作用與SB203580相似，提示PIO部分通過抑制p38MAPK通路調控TGF-β1表達。

（本文圖1～3見插圖2-2）

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Effects of pioglitazone on the expressions of p38 m itogen-activated p rotein kinase and transform ing grow th factorβ-1 in cultured rat glomerular mesangial cells

WANG Shan，YE Shandong，SUN Wenjia，HU Yuanyuan （Department of Endocrinology，Anhui Provincial Hospital Affiliated to AnhuiMedical University，Hefei230001，China）

YE Shandong，Email：ysd196406＠163.com

ObjectiveTo observe the effects of pioglitazone on the expressions of p38 mitogen-activated protein kinase（p38MAPK）and transforming growth factorβ-1（TGF-β1）in cultured rat glomerular mesangial cells（MCs）and explore its reno-protectivemechanism.MethodsMCswere cultured in themedium with normal glucose concentration（group NG），high glucose concentration（group HG），p38MAPK special inhibitor（group S）and pioglitazone（group P）.The expression levels of phosphory1ated p38MAPK（p-p38）and total p38MAPK（t-p38）were measured by Western blot.The expressions of TGF-β1 mRNA were detected by semiquantitative RT-PCR.ResultsCompared with group NG，the p38MAPK activity and TGF-β1mRNA expression increased significantly（P＜0.01）in group HG.Compared with group HG，p38MAPK special inhibitor inhibitedmarkly HG-induced p38MAPK activity and TGF-β1 expression（P＜0.05）.When treated with pioglitazone，p38MAPK activity and TGF-β1 expression decreased（P＜0.05），which were similar to group S.p38MAPK activity was positively correlated with TGF-β1 expression（r＝0.587，P＜0.01）.Conlusions Pioglitazone can suppress TGF-β1 expression of MCs via p38MAPK pathway，which may contribute partly to its reno-protection.

Diabetic nephropathies；Mesangial cells；p38 mitogen-activated protein kinases；Transforming growth factor beta 1；Thiazolidinediones

R587.24

A

10.3969／J.issn.1672-6790.2014.02.018

2013-08-10）

安徽省自然科學基金（11040606M161）；安徽高校省級自然科學研究項目（KJ2011A157）

汪姍，碩士在讀，Email：nono142587＠163.com

葉山東，主任醫師，教授，博士生導師，Email：ysd196406＠163.com