RhoB和E-cadherin在非小細胞肺癌組織中的表達及臨床意義

譚祎媚 張 遜 徐美林 王 菁 徐醫軍

RhoB和E-cadherin在非小細胞肺癌組織中的表達及臨床意義

譚祎媚1張 遜2△徐美林3王 菁3徐醫軍2

目的探討非小細胞肺癌（NSCLC）中RhoB和E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達及其臨床意義。方法采用免疫組化Super Pic TureTMPolymer二步法，檢測116例NSCLC組織（NSCLC組）和同期116例正常余肺組織（正常組）中RhoB和E-cadherin的表達，并分析其表達與患者臨床病理特征及預后的關系。結果NSCLC組RhoB、E-cadherin陽性表達率均低于正常組（57.76%vs 87.07%，54.31%vs 85.34%，均P＜0.01）。NSCLC組織中RhoB的表達強度在不同腫瘤病理類型、腫瘤分化程度及淋巴結轉移情況間的差異有統計學意義，E-cadherin的表達強度在不同TNM分期、腫瘤分化程度及淋巴結轉移情況間的差異有統計學意義。NSCLC組RhoB與E-cadherin的表達呈正相關（r= 0.503，P＜0.01）。RhoB高表達的患者3年生存率高于低表達者（83.93%vs 40.00%，Log-rank χ2=18.992，P＜0.01）；E-cadherin高表達的患者3年生存率高于低表達者（85.11%vs 44.93%，Log-rank χ2=16.680，P＜0.01）。RhoB和E-cadherin共同低表達、淋巴結轉移是影響NSCLC患者預后的危險因素。結論RhoB與E-cadherin在NSCLC組織中的表達呈現較好的相關性，檢測二者的表達對判斷NSCLC患者的臨床病理學特征及預后有一定提示作用。

癌,非小細胞肺；鈣黏著糖蛋白類；免疫組織化學；預后；Kaplan-Meiers評估；RhoB；E-鈣黏蛋白

肺癌中85%為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），大量研究證明，NSCLC的侵襲與轉移是造成其不良預后的主要原因[1]。Rho亞家族成員RhoB在腫瘤發生過程中是一個負調節因子，具有抑制某些腫瘤細胞增殖、上調細胞凋亡以及抑制炎癥反應的作用[2]。E-鈣黏蛋白（E-cadherin）是分布在所有上皮組織中的跨膜糖蛋白，它具有促進上皮細胞間相互黏附、保持組織結構完整性的作用[3]。肺癌組織中RhoB、E-cadherin的表達及其與患者臨床病理特征的關系已有相關研究，但其與患者預后關系的臨床報道不多。本研究采用免疫組化法檢測NSCLC組織及正常肺組織中RhoB、E-cadherin蛋白的表達，探討其與NSCLC患者臨床病理特征及預后的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象及標本來源 選取天津市胸科醫院2008年1月—12月NSCLC患者116例（NSCLC組），其中男85例，女31例。年齡32～78歲，平均（60.38±9.84）歲；所有病例均經病理證實，術前未經過放化治療。按照UICC（Union for International Cancer Control）2009年修訂的pTNM分期標準：Ⅰ期47例，Ⅱ期30例，Ⅲ期39例。按照WHO肺癌分類標準：鱗癌62例，腺癌39例，腺鱗癌15例。高、中分化86例，低分化30例。有淋巴結轉移59例，無淋巴結轉移57例。另收集同一患者的距癌組織＞5 cm、經HE染色證實無癌細胞浸潤的正常余肺組織116例（正常組）。隨訪日期從2008年2月1日—2013年1月31日，生存期的計算從手術日期到隨訪截止日期，或由于復發、轉移而死亡的日期為止。所有標本的使用均經天津市胸科醫院倫理委員會同意，取得患者或家屬的知情。

1.2 材料和試劑 兔抗人RhoB抗體、兔抗人E-cadherin抗體均購自北京博奧森生物技術有限公司，快捷型酶標羊抗鼠/兔IgG聚合物及二氨基聯苯胺（DAB）顯色試劑盒購自福州邁新生物技術開發有限公司。

1.3 方法 手術切除后標本迅速經10%中性福爾馬林固定，常規石蠟包埋后連續切片，厚度5 μm，采用常規免疫組化Super Pic TureTMPolymer二步法檢測，嚴格按照說明書進行操作，抗原修復采用高壓高溫熱修復。采用已知陽性切片作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 陽性結果判斷 RhoB蛋白主要表達于細胞的膜結構上；E-cadherin陽性表達主要位于細胞膜，部分位于細胞質。根據染色細胞百分率和染色程度進行評定和分析：每例均隨機觀察10個高倍視野（×400），每個視野計數100個細胞，陽性細胞率=陽性細胞數/觀察細胞數×100%。陽性細胞率計分標準：≤10%為0分，11%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。染色強度：黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將陽性細胞率得分和染色強度得分相乘即為最后得分：0分為陰性（-），1～4分為弱陽性（+），5～8分為中度陽性（++），9～12分為強陽性（+++）。在分析時將（-）和（+）定為低表達，（++）和（+++）定為高表達。

1.5 統計學方法 采用SPSS 17.0軟件進行數據處理，計數資料組間比較采用χ2檢驗，相關性分析用Spearman等級相關，對生存數據采用Kaplan-Meier分析并繪制生存曲線，應用Log-rank檢驗差異性，采用COX風險模型進行預后因素分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2組RhoB和E-cadherin的陽性表達情況比較 NSCLC組RhoB、E-cadherin陽性表達率均低于正常組（均P＜0.01），見表1。2組RhoB主要表達于膜結構上（細胞膜或核膜），E-cadherin表達于細胞膜，正常組RhoB和E-cadherin的陽性表達均為高表達，見圖1～6。

Table 1 Comparison of positive expressions of RhoB and E-cadherin between two groups表1 2組RhoB、E-cadherin的陽性表達情況 例（%）

2.2 NSCLC組RhoB、E-cadherin表達與患者臨床病理特征的關系 RhoB、E-cadherin的表達強度在不同性別、年齡、吸煙與否、腫瘤部位、腫瘤最大直徑間差異均無統計學意義。不同腫瘤病理類型、腫瘤分化程度及淋巴結轉移情況下，RhoB在NSCLC組織中的表達強度差異有統計學意義；不同腫瘤分化程度、TNM分期及淋巴結轉移情況下，E-cadherin在NSCLC組織中的表達強度差異有統計學意義，見表2。

2.3 NSCLC組RhoB與E-cadherin表達的相關性分析 NSCLC組RhoB與E-cadherin的表達呈正相關（r=0.503，P＜0.01），見表3。

2.4 RhoB、E-cadherin的表達與NSCLC患者預后的關系 116例NSCLC患者隨訪1～60個月，中位數44個月，失訪3例。RhoB高表達和低表達患者3年生存率分別為83.93%（47/56）和40.00%（24/60），差異有統計學意義（Log-rank χ2=18.992，P＜0.01），見圖7。E-cadherin高表達和低表達患者3年生存率分別為85.11%（40/47）和44.93%（31/69），差異有統計學意義（Log-rank χ2=16.680，P＜0.01），見圖8。RhoB與E-cadherin共同高表達及共同低表達者的3年生存率分別為89.19%（33/37）、34%（17/50），差異有統計學意義（Log-rank χ2=24.385，P＜0.01），見圖9。

2.5 多因素COX回歸模型分析 以性別（男=1，女= 2）、年齡、病理類型、腫瘤分化程度、腫瘤最大直徑、是否有淋巴結轉移（是=1，否=2）及RhoB、E-cadherin是否共同低表達（是=1，否=2）為自變量，以生存時間為因變量，應用COX比例風險回歸模型進行分析。結果顯示RhoB和E-cadherin共同低表達、淋巴結轉移是影響NSCLC患者預后的危險因素，見表4。

Table 2 Comparison of expression intensities of RhoB and E-cadherin between different clinical pathological characteristic groups of NSCLC表2 RhoB、E-cadherin的表達與NSCLC患者臨床病理特征的關系 例（%）

Table 3 The correlation of expressions of RhoB and E-cadherin in NSCLC group表3NSCLC組RhoB與E-cadherin表達的相關性分析

Figure 7 The correlation between the expression of RhoB and the survival time of patients with NSCLC圖7 RhoB的表達與NSCLC患者生存時間的關系

Figure 8 The correlation between the expression of E-cadherin and the survival time of patients with NSCLC圖8 E-cadherin的表達與NSCLC患者生存時間的關系

Figure 9 The correlation between the high expression of both RhoB and E-cadherin,the low expression of both RhoB and E-cadherin and the survival time of patients with NSCLC圖9 RhoB和E-cadherin共同高表達及共同低表達與NSCLC患者生存時間的關系

Table 4 Results of COX proportional hazards model for various prognostic factors in patients with NSCLC表4 COX比例風險回歸模型分析結果

3 討論

RhoB是Rho家族中一個較為獨特的分子，在腫瘤惡性發展過程中，RhoB的表達通常是減弱的，體外實驗也發現RhoB可抑制腫瘤細胞增殖、存活、侵襲和轉移[4]。Bousquet等[5]通過RNA干擾敲除支氣管非腫瘤細胞中的RhoB基因，發現RhoB表達降低可促進細胞遷移和侵襲。Mazieres等[6]研究發現，隨著肺癌浸潤性增高，RhoB在癌組織中的表達量大幅度下降，同時RhoB表達丟失與肺癌的高分期、高浸潤性、低分化、高增殖指數等存在顯著相關性，而RhoB過表達的A549細胞的增殖、生長等均顯著下降。Sato等[7]研究顯示112例原發NSCLC中有64例RhoB為不表達或低表達，與本研究結果一致。本研究中RhoB在正常余肺組織中呈高表達，在NSCLC組織中表達顯著降低，且其在不同腫瘤病理類型、腫瘤分化程度及淋巴結轉移情況間表達強度不同。

E-cadherin陽性表達有抑制腫瘤轉移的功能，E-cadherin表達下降或缺失，細胞黏附力下降，造成細胞容易分散而向外周浸潤性生長，一旦獲得轉移的必要條件，就可脫離原發灶而發生侵襲和轉移[3]。近年來通過在肺癌、乳腺癌、甲狀腺乳頭狀癌、膀胱癌、前列腺癌、大腸癌及鼻咽癌等腫瘤的研究中證實，E-cadherin表達降低與腫瘤的分化、侵襲和轉移有顯著相關性[8]。本研究中E-cadherin同樣在大部分NSCLC組織中表達顯著降低，其表達強度在不同TNM分期、腫瘤分化程度及淋巴結轉移間有差異。

本研究結果顯示，RhoB和E-cadherin共同高表達或共同低表達更容易出現在腺鱗癌、低分化、高分期及有淋巴結轉移的患者中，且RhoB和E-cadherin共同低表達是致使NSCLC患者預后較差的危險因素。NSCLC組織中RhoB與E-cadherin的表達具有較好的相關性和一致性，提示RhoB和E-cadherin在促進腫瘤的發生、浸潤的信號傳導通路中發揮著相似的作用。RhoB在肺癌中的低表達或不表達可能主要是由組蛋白低乙酰化所引起，在應用組蛋白去乙酰化酶抑制劑處理后的肺癌細胞系中可見顯著的RhoB低表達[9]。而RhoB低表達可促進支氣管上皮細胞的遷移和浸潤，其主要是通過激活絲/蘇氨酸蛋白激酶（Akt）并依賴于Rac1的激活，從而導致磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-Akt信號通路被激活［5]。Kazerounian等[10]發現RhoB缺失可促進腫瘤的生成及腫瘤細胞的生長，促進Akt信號傳導通路在乳腺癌腫瘤細胞的發生。Howe等[11]提出RhoB在內皮細胞的遷移、出芽和毛細血管形成中發揮重要作用，其部分機制為抑制RhoA/ROCK信號通路。由此可見，RhoB表達丟失可能是肺癌細胞獲得浸潤性的特征之一，其作用機制可能和PI3K/Akt信號通路被激活有關。研究還發現，E-cadherin通過介導表皮生長因子受體對PI3K/Akt的激活而對腫瘤細胞增殖產生作用[12]。E-cadherin可抑制NSCLC細胞的增殖和浸潤，可能通過下調RhoA或Cdc42的表達來實現，當敲除RhoA或Cdc42基因，使NSCLC細胞增殖和浸潤能力均顯著下降[13]。可見，RhoB和E-cadherin在腫瘤發生發展的信號傳導通路中有一定的交叉點。

Figure 1 The expression of RhoB in squamous carcinoma圖1 RhoB在鱗癌中的表達（SP，×400）

Figure 2 The expression of RhoB in adenocarcinoma圖2 RhoB在腺癌中的表達（SP，×400）

Figure 3 The expression of E-cadherin in adenocarcinoma圖3 E-cadherin在腺癌中的表達（SP，×400）

Figure 4 The expression of E-cadherin in squamous carcinoma圖4 E-cadherin在鱗癌中的表達（SP，×400）

Figure 5 The expression of RhoB in the normal lung tissue圖5 RhoB在正常余肺中的表達（SP，×400）

Figure 6 The expression of E-cadherin in the normal lung tissue圖6 E-cadherin在正常余肺中的表達（SP，×400）

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（2013-06-01收稿 2013-08-01修回）

（本文編輯 陳麗潔）

The Expression and Clinical Significance of RhoB and E-Cadherin in Non-Small-Cell Lung Cancer Tissues

TAN Yimei1，ZHANG Xun2，XU Meilin3，WANG Jing3，XU Yijun2
1 Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China；2 Department of Thoracic Surgery,3 Department of Pathology,Tianjin Chest Hospital

ObjectiveTo investigate the expressions of RhoB and E-cadherin in non-small-cell lung cancer (NSCLC),and their clinical significances thereof.MethodsImmunohistochemical staining was applied to detect expressions of RhoB and E-cadherin in 116 samples of NSCLC(NSCLC group)and 116 samples of normal lung tissues(control group).Correlations of expressions of RhoB and E-cadherin to clinical pathological parameters and prognosis were analyzed in two groups.ResultsThe expression intensities of RhoB and E-cadherin were significantly lower in NSCLC group than those in control group(57.76%vs 87.07%，54.31%vs 85.34%，P＜0.01).There were significant differences in the expression of RhoB between different pathological types,differentiation and lymph node metastasis in NSCLC group.There were significant differences in the expression of E-cadherin between different TNM stages,differentiation and lymph node metastasis in NSCLC group.The expression of RhoB was positively correlated with the expression of E-cadherin(r=0.503，P＜0.01).The 3-year survival rates were significantly higher in patients with high expression of RhoB(83.93%)than those in patients with low expression of RhoB(40.00%,Log-rank χ2=18.992，P＜0.01).The 3-year survival rates were significantly higher in patients with high expression of E-cadherin(85.11%)than those in patients with low expression of E-cadherin (44.93%,Log-rank χ2=16.680，P＜0.01).Further multivariate analysis suggested that both lower expressions of RhoB and E-cadherin and lymph node metastasis were prognostic indicators for NSCLC(P＜0.001).ConclusionThe expressions of RhoB and E-cadherin showed a good correlation in NSCLC.Detecting the expression of RhoB combined with E-cadherin may give a clue on clinicopathological features and prognosis in patients with NSCLC.

carcinoma，non-small-cell lung cancer;cadherins;immunohistochemistry;prognosis;Kaplan-Meiers estimate;RhoB;E-cadherin

R734.2

A【DOI】10.3969/j.issn.0253-9896.2014.01.009

1天津醫科大學（郵編300070）；2天津市胸科醫院胸外科，3病理科

△通訊作者 E-mail：zhangxun69@163.com