復方中藥對免疫抑制小鼠免疫促進作用的研究

屈新輝 劉春發 胡建新 何 丹 項正兵 吳曉牧

1.江西省人民醫院神經內科，江西南昌 330006；2.江西省神經病學研究所，江西南昌 330006；3.南昌大學醫學院，江西南昌 330006；4.江西省人民醫院藥劑科，江西南昌 330006

免疫學是現代醫學發展極為迅速的學科之一，疾病發生發展很多都與免疫功能有關，某些腫瘤患者在放療、化療后或一些病毒感染后致免疫性力低下，但臨床增強免疫力有明顯臨床療效的藥物卻不多見。祖國醫學認為“正虛邪擾”，疾病與人體的抵抗力密切相關，并且臨床處方運用扶正祛邪的法則治療疾病，臨床觀察亦有療效，許多學者研究了多種單味藥對免疫功能的調節作用，嘗試發現、提取、合成能調節免疫的化合物，本實驗旨在從細胞及分子水平出發，探求中藥復方對免疫功能增強的作用及效能，在扶正固本、活血益氣的中藥中遴選出有廣闊應用前景的促進免疫的中藥復方。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 中藥的制備

復方中藥（由西洋參、黃芪、枸杞、當歸等多味藥）組成，按總量400 g（西洋參96 g、黃芪96 g、枸杞128 g、當歸80 g）稱取處方各藥（由江西省人民醫院藥劑科供應），加蒸餾水400 mL，浸泡24 h，隔水煮1 h，濾過藥液，藥渣再加蒸餾水適量，煮1 h，濾出藥液，合并兩次藥液，隔水濃縮至400 mL，即每1 mL相當于1 g生藥的原液，滅菌封存備用。

1.1.2 實驗動物

6 周齡昆明小鼠 50 只，體重（20±2）g，雌雄各半，均購自江西中醫學院。動物自由飲食、飲水，動物質量合格證號：JIDW NO.2012-0041。試驗過程中對動物的處置符合2006年科技部關于對試驗動物的有關規定[1]。

1.1.3 試劑與儀器

免疫抑制劑環磷酰胺（江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，批號：12030625），為 200 mg/支的粉針劑；小鼠IgG和補體C3的ELISA檢測試劑盒為西唐生物公司進口分裝產品（批號分別為：1208061、1208201）；Anti-MouseCD3（PE-Cy5）、Anti-MouseCD4（FITC）、Anti-Mouse CD8 （PE）、Anti-Mouse CD19 （PE）、Anti-MouseCD49（FITC）、Anti-MouseIL-2（PE）、Anti-MouseIFN-γ（FITC）熒光抗體 （購于eBioscience Inc.San Diego，CA公司，批 號 分 別 為 E06065-1630、E00077-1630、E01036-1633、E01047-1630、E00752-1630、E02060-1630、E00862-1631）；BECKMAN COULTER流式細胞儀；酶標儀（550 型）；倒置顯微鏡（Leica）；光學顯微鏡（OLYMPUS）；紅細胞裂解液（實驗室制自備）；PBS緩沖液（實驗室制自備）；16號小鼠灌胃針；Allegra 64R低速冷凍離心機 （BECKMAN COULTER，rmax=204 mm）；HC電子天平（0.1 g）、sarrorious 電子天平（0.001 g），300目金屬篩網。

1.2 方法

1.2.1 藥物急性毒理試驗

該復方中藥各組份臨床應用廣泛，未見明顯毒副作用，因此用小鼠灌胃最大容量0.4 mL/10 g[2]來檢查藥物的LD50，取20只小鼠，每次灌胃復方中藥0.8 mL，2次/d，觀察 15 d，無一死亡，可見 LD50＞ 0.4 mL/10 g。

1.2.2 實驗分組

應用隨機數字表法進行隨機將動物分為5組：正常對照組、模型對照組、低劑量中藥組、中劑量中藥組、高劑量中藥組。每組10只，雌雄各半。將需隨機分組的雌雄性小鼠分別稱重，按序編號記錄體重結果，給每只小鼠鼠分配一個隨機數，按隨機數字大小升序排序，按排序后的順序依次將小鼠分入各個劑量組 。各組體重均值再做F檢驗（單因素方差分析），需滿足P＞0．05，如果條件不能滿足，則重復以上過程，直到滿足為止。隨機分組結束后，分別按各組的原始編號編上實驗編號。

1.2.3 小鼠免疫抑制模型

建立小鼠免疫抑制模型一次性腹腔注射環磷酰胺200 mg/kg，造模完成[3]，正常對照組注射環磷酰胺溶劑生理鹽水4 mL/kg。

1.2.4 給藥方法

中藥治療組于環磷酰胺造模后第2天開始用中藥按小鼠體重灌胃，高劑量中藥組灌中藥0.04 mL/g，中劑量中藥組灌中藥0.02 mL/g+蒸餾水0.02 mL/g，低劑量中藥組灌中藥0.01 mL/g+蒸餾水0.03 mL/g，正常對照組、模型對照組均灌蒸餾水0.04 mL/g，喂服14 d。

1.2.5 實驗指標的檢測

1.2.5.1 體重和脾臟指數 各組小鼠稱量體重，于試驗結束后斷頸處死，取脾臟，用電子天平稱濕重，計算脾指數，脾臟指數=100%脾臟質量/體質量（g/g）。

1.2.5.2 IgG和補體C3的檢測 于試驗第14天摘取眼球取血，室溫放置2 h后3000 r/min離心10 min將血清和紅細胞迅速小心地分離，離心得血清后嚴格按照ELISA試劑盒說明書方法檢測小鼠血清IgG和補體C3水平。

1.2.5.3 脾淋巴細胞 CD3、CD4、CD8、CD19、CD49b NK細胞、細胞因子IL-2、IFN-γ檢測 第14天取小鼠脾臟研磨成單細胞懸液經篩網過濾于離心管中離心，棄上清再加入紅細胞裂解液離心，棄上清后加入PBS定容至1 mL，用倒置相差顯微鏡進行細胞計數，調節細胞數為 1×107～10×107個， 加入標記抗小鼠 CD3、CD4、CD8、CD19、CD49b NK 細胞、 細胞因子 IL-2、IFN-γ熒光抗體抗體，4℃避光孵育30 min，PBS洗滌2次，流式細胞儀檢測淋巴細胞和細胞因子指標的變化。

1.3 統計學方法

采用SPSS 19.0統計分析軟件分析，所有計量資料數據以均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗。將資料進行正態性分析和Levene法方差齊性檢驗，行兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊性采用LSD-t檢驗，方差不齊采用Tamhane法檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 體重和脾指數結果比較

正常對照組和模型對照組與各治療組第1天的體重均值比較，差異無統計學意義（P=0.216＞0.05），表明隨機分組成功。第14天的體重模型對照組比正常對照組減輕，差異有統計學意義（P=0.020＜0.05），而模型對照組與各治療組體重比較，差異無統計學意義（P=0.126、0.904、0.796，均 P ＞ 0.05），表明小鼠免疫抑制后引起體重減輕，而各復方中藥治療組對免疫抑制小鼠體重無影響。脾指數模型對照組比正常對照組降低（P=0.0001＜0.05），而模型對照組與各治療組比較，差異無統計學意義（P=0.967、0.255、0.941 ＞ 0.05），表明小鼠免疫抑制后引起脾指數降低，而各復方中藥治療組對免疫抑制小鼠脾指數無影響。見表1。

表1 各組體重和脾指數比較（x±s）

2.2 各組抗體IgG、補體及CD19結果比較

模型對照組比正常對照組IgG顯著增高（P=0.002＜0.01），C3顯著降低（正態分布方差不齊t檢驗，P=0.011＜0.05），而低劑量中藥組與模型對照組比較，差異有高度統計學意義（P=0.001＜0.01），表明低劑量中藥組能顯著降低免疫抑制小鼠抗體IgG的濃度，升高免疫抑制小鼠補體C3濃度。見表2。

表2 抗體、補體及B淋巴細胞表面抗原CD19結果比較（x±s）

2.3 各組脾淋巴細胞 CD3＋、CD4＋、CD8＋、CD4＋/CD8＋結果比較

CD3+、CD4+、CD8+模型對照組均值均低于正常對照組 （P ＜ 0.05），CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+模型對照組水平與低劑量中藥組、中劑量中藥組、高劑量中藥組水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05），顯示復方中藥對特異性T淋巴細胞和B淋巴細胞免疫無促進作用。見表3。

表3 T淋巴細胞表面抗原結果比較（x±s）

2.4 各組脾淋巴細胞CD49b+結果比較

CD49b+、IL-2、IFN-γ 模型對照組水平均低于正常對照組，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01），低劑量中藥組、中劑量中藥組、高劑量中藥組均值均增高，但僅低劑量中藥組CD49b+與模型對照組比較，差異有高度統計學意義（P=0.008＜0.01），表明小劑量復方中藥對免疫抑制小鼠非特異性免疫NK細胞有免疫促進作用。IL-2、IFN-γ低劑量中藥組、中劑量中藥組與模型對照組比較，差異有統計學意義（IL-2：P=0.004、P=0.039；IFN-γ：P=0.026、P=0.024，P ＜ 0.05或P＜0.01），表明小劑量、中劑量復方中藥對免疫抑制小鼠非特異性免疫細胞因子IL-2及IFN-γ有免疫促進作用。見表4。

表4 各組NK細胞及細胞因子比較（%，x±s）

3 討論

機體的免疫功能主要與T淋巴細胞和B淋巴細胞、單核巨噬細胞、NK自然殺傷細胞等免疫細胞及抗體、補體、免疫細胞產生的細胞因子有關。特異性免疫與T淋巴細胞、B淋巴細胞及B淋巴細胞活化產生的抗體有關，非特異性免疫與單核巨噬細胞、NK自然殺傷有關，而補體及細胞因子廣泛參與特異性免疫與非特異性免疫。根據中醫藥理論和現代藥理研究表明：西洋參補氣養陰，清熱生津，主要活性成分為皂苷類、多糖類和氨基酸類等，其中的活性多糖可以通過激活網狀內皮系統、補體、激活巨噬細胞和T、B淋巴細胞，誘生多種免疫因子等途徑對機體免疫產生廣泛的影響，從而提高機體免疫力[4]；黃芪益氣固表，能調節免疫功能，可治療氣虛感冒；枸杞滋補肝腎，能提高機體免疫功能，延緩抗衰老，長期服用可增強免疫功能；當歸補血活血，具有抗炎和改善血管功能的作用[5]。本文以常用補益劑西洋參、黃芪、當歸、枸杞組成的復方中藥湯劑為研究對象，全方具有補氣活血、滋補肝腎，滋陰益陽作用，觀察其對免疫器官、免疫細胞、抗體、補體、細胞因子等不同層面免疫功能的影響，探求其增強免疫的機制。

正常對照組和模型對照組與各治療組第1天的體重均值比較差異無統計學意義（P＞0.05），表明隨機分組成功。環磷酰胺為常有免疫抑制劑，為細胞周期非特異性細胞毒藥物，其免疫抑制機制為對骨髓強大抑制作用，致T、B淋巴細胞絕對數量減少，并抑制淋巴細胞受特異性抗原刺激后母細胞的轉化[6]。本實驗采用其制作免疫抑制動物模型，實驗結束后觀察到體重、脾指數、CD3+、CD4+、CD8+、CD19+、NK 細胞、補體C3、細胞因子IL-2、IFN-γ均降低，且差異有統計學意義（P＜0.05），表明建立免疫抑制動物模型成功。模型對照組與各治療組體重和脾指數無差異（P＞0.05），各復方中藥治療組對免疫抑制小鼠體重和脾指數無影響，表明其在免疫器官層面無顯著性作用。脾指數模型對照組比正常對照組降低（P=0.0001），可能與促進免疫器官的生長作用因環磷酰胺對機體抑制作用過強而顯現不出來有關。

本實驗觀察復方中藥各劑量組與模型組比較對CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、CD19+均無差異，因此未能證實其對特異性細胞免疫及體液免疫有促進作用。以往有報道西洋參多糖對60℃射線照射致免疫抑制模型小鼠可增強Con A誘導的小鼠脾T淋巴細胞轉化能力，增強小鼠遲發型變態反應能力[7]；黃芪多糖對正常小鼠可增強Con A誘導的小鼠脾T淋巴細胞轉化能力[8]；當歸多糖明顯促進健康人外周血T淋巴細胞增殖[9]；枸杞多糖明顯增強植物凝集素PHA活化的人外周血淋淋巴細胞的增殖[10]。復方中藥中四種單味藥均可促進T淋巴細胞免疫力，而組成的復方反而未得出促進T淋巴細胞免疫的結論，這可能與免疫模型不同引起藥物對機體敏感性不同有關，還與觀察T淋巴細胞指標不同及檢測方法不同有關。

補體是存在于血清和組織液中經活化后具有酶活性的蛋白質，補體成分可與多種免疫細胞相互作用，調節細胞增殖、分化，補體C3等可參與固定抗原，使抗原易被APC處理與遞呈，參與免疫應答的誘導，并參與清除免疫復合物及免疫記憶，補體系統是具有重要生物學作用的效應級聯放大系統。補體途徑分為經典、替代和外源凝集素途徑[11]，補體C3是補體激活的三個級聯的一個關鍵組成部分[12]，因此本實驗選擇補體C3指標作為觀察補體系統功能。低劑量中藥組與模型對照組比較補體C3顯著升高（P=0.0001＜0.01），表明低劑量中藥組能顯著升高免疫抑制小鼠補體C3濃度，顯著促進免疫抑制小鼠補體系統的功能。

本實驗免疫抑制模型對照組與正常對照組比較抗體IgG是升高的，差異有高度統計意義（P=0.002），而高劑量中藥組、中劑量中藥組、低劑量中藥組IgG均值依次降低，且低劑量中藥組與模型對照組比較，差異顯著（P值=0.001），表明低劑量中藥組能顯著降低免疫抑制小鼠抗體IgG的濃度。機體抗原免疫后血清中的抗體其中IgM檢出時間最早，IgG檢出時間較晚但存留時間最長，IgA檢出時間最晚[13]。本實驗B淋巴細胞抗原CD19+在免疫抑制后下降，因IgG產生時間較晚但存留時間最長，在實驗14 d的時間節點上，IgG主要是造模前存留的，因此理論上模型組與正常對照組應無統計學差異。通常抗原與抗體結合，在補體的參與下，抗原與抗體結合產生幾何級聯放大效應，清除抗原的同時消耗了抗體，補體升高會導致抗體降低，補體降低也會導致抗體升高。本實驗免疫抑制后對補體也造成了強大的抑制，因而出現正常對照組IgG抗體低，模型組IgG抗體升高。本實驗B淋巴細胞抗原CD19+各中藥治療組與模型組無差異，其一定程度上反映了機體體液免疫功能，體液免疫產生的抗體理論上亦無差異，因此認為低劑量中藥組IgG降低是因為低劑量復方中藥可顯著升高補體所引起的。

NK自然殺傷細胞對病原體無嚴格選擇性，能識別多種病原體的共有成分，對多種病原體均有吞噬、殺傷作用。NK細胞是產生細胞因子IFN-γ主要的先天免疫細胞，NK細胞不需要事先暴露于抗原發揮其功能，通過自然的細胞毒性和的分泌細胞因子發揮防止微生物的侵襲和傳播的重要的免疫效應，NK細胞是天然免疫和獲得性免疫功能之間的橋梁，先天第一線防御癌癥和病原體的入侵的關鍵[14]。CD49是小鼠NK細胞主要標志物，本實驗選用其作為觀察NK細胞的功能指標。復方中藥低劑量組與模型組比較可顯著升高CD49（P=0.008＜0.01），顯示低劑量復方中藥能有效促進NK自然殺傷細胞數量。在此需要說明的是復方中藥表現出的對機體免疫促進作用并不是由于中和環磷酰胺的藥效而引起的，因為環磷酰胺的半衰期為4 h，24 h后已經過了6個半衰期，機體環磷酰胺的血藥濃度僅有1/64，因此24 h后喂服中藥不存在中和環磷酰胺的藥效，表明小劑量復方中藥對免疫抑制小鼠非特異性免疫NK細胞有免疫促進作用。

輔助性Th1細胞受抗原刺激分泌細胞因子IL-2和IFN-γ，IL-2刺激CTL細胞增殖與分化，IFN-γ可誘導單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、皮膚成纖維細胞、血管內皮細胞、星狀細胞等MHCⅡ類抗原的表達，使其參與抗原提呈和特異性免疫的識別過程；IFN-γ還能增強巨噬細胞表面受體Fc的表達，促進巨噬細胞吞噬免疫復合物、抗體包被的病原體和腫瘤細胞[15]；IL-2和IFN-γ都可以增強NK細胞細胞毒活性。因此IL-2和IFN-γ是反映機體免疫功能的重要指標。本實驗中劑量中藥組及低劑量中藥組與模型組比較均能升高IL-2和IFN-γ（P＜0.05），表明一定劑量范圍的復方中藥對免疫細胞因子有促進作用。

本實驗復方中藥藥理毒理試驗未發現明顯毒副作用，但高劑量中藥組對所有免疫指標均無促進作用，說明藥物劑量過大對機體還是有一定的不利影響，中藥中既使補益藥，也有一定的副作用。雖然都是補氣養陰活血的補益藥，正應了中醫理論有“氣有余便是火”，補氣有余易產生火邪。

因此，復方中藥（由西洋參、黃芪、枸杞、當歸等多味藥組成）在一定劑量范圍內，雖然還未能證實對機體特異性細胞免疫和體液免疫有促進作用，但對非特異性細胞免疫及體液免疫有顯著促進作用。

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