控制性低壓后處理對兔脊髓缺血再灌注損傷的影響及其機制探討

艾春雨，江曉菁，馬 虹，王俊科

(中國醫科大學附屬第一醫院，沈陽110001)

脊髓缺血再灌注損傷是脊柱手術、動脈瘤手術中常見的中樞神經系統損傷。截癱是脊髓缺血再灌注損傷后難以預測和最為嚴重的并發癥之一［1］。研究發現，對正在發生心肌梗死的患者行冠狀血管成形、支架植入后血管再通即刻行3個循環的氣囊放氣充氣處理，可使心肌梗死范圍縮小、反映心肌再灌注的指標分級增加，且無不良反應，提示該球囊式缺血后處理具有心肌保護作用［2，3］。將再灌注早期灌注壓控制在較低水平(45～55 mmHg)，即控制性低壓后處理，沒有附加缺血，操作簡便，更易于臨床應用。我們于2012年1～12月進行本研究，探討控制性低壓后處理對兔脊髓缺血再灌注損傷的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 日本大耳白兔32只，雄性，體質量2～2.5 kg，由中國醫科大學實驗動物中心提供。隨機分為4組，每組8只，即假手術對照組(S組)、缺血再灌注組(I/R組)、控制性低壓后處理組(P組)、控制性低壓后處理+ERK1/2抑制劑PD98059組(PD組)。

1.2 方法

1.2.1 缺血再灌注模型的制備 方法參照文獻［3］。模型制備前12 h禁食，自由飲水。耳緣靜脈注射20%烏拉坦1 mg/kg麻醉;常規監測心率和血壓;耳緣中動脈穿刺置管，監測近端動脈血壓;股動脈穿刺置管監測遠端動脈血壓;應用電熱毯保溫，維持直腸溫度(38.5±0.5)℃;耳緣靜脈穿刺置管，靜脈輸注復方乳酸鈉林格氏液4 mL/(kg·h);將4 F球囊充氣導管置于左腎動脈下1cm水平，靜注肝素150 U/kg后5 min，阻斷腹主動脈進行缺血，遠端動脈壓＜20 mmHg為缺血成功的標準，缺血25 min時進行再灌注，動脈搏動恢復為再灌注成功的標準。缺血后處理方法參照前期研究［4］。

1.2.2 鞘內注射方法 于L5～6間隙行蛛網膜下腔穿刺，將已消毒的 PE-10導管從 L5～6插入7.0～8.0cm，至脊髓胸段以回抽到腦脊液作為穿刺成功的標志。緩慢抽出等量腦脊液后注入實驗藥物，注射后保持頭高腳低體位1 h。

1.2.3 各組處理方法 ① S組:將4 F球囊充氣導管置于左腎動脈下1cm水平，不行阻斷。② I/R組:再灌注時排空球囊，其余方法同1.2.1。③ P組:再灌注開始10 min后，將球囊部分排空，使腹主動脈遠端血壓控制在45～55 mmHg，10 min后球囊完全開放，其余方法同1.2.1。④ PD組:于腹主動脈開放前1 min鞘內注射 PD98059(3 μg/20 μL)，其余方法同P組。于再灌注24 h時，腹腔注射20%烏拉坦1 mg/kg，處死動物。

1.2.4 指標檢測

1.2.4.1 細胞凋亡 采用TUNEL法。取L3～4節段脊髓組織，10%甲醛溶液中固定，脫水、切片后，檢測細胞凋亡，嚴格按照TUNEL試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)說明書進行操作。在高倍鏡下(×400)隨機選擇6個不重復視野，計數細胞凋亡數和細胞總數，取平均值，計算凋亡指數。凋亡指數=凋亡細胞數/細胞總數×100%。細胞核呈棕黃色為凋亡細胞。

1.2.4.2 脊髓組織超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量測定 羥胺法測定脊髓組織SOD含量，硫代巴比妥酸法測定脊髓組織MDA含量。

1.2.4.3 脊髓組織 p-ERK1/2、Caspase-3檢測 采用免疫細胞化學SP法。取L4～5節段脊髓組織，10%甲醛固定，脫水，石蠟切片(5 μm)。免疫組化步驟參照HistostainTMPlus Kits S-P 9000免疫組化染色試劑盒說明書(武漢博士德生物工程有限公司)。p-ERK1/2多克隆抗體稀釋度為1∶500、Caspase-3抗體稀釋度為1∶100。細胞核及胞質內有棕黃色顆粒為陽性細胞。光鏡下(×400)隨機選擇6個視野，采用AX70顯微圖像分析系統(Olympus公司，日本)進行分析，以平均光密度值反映p-ERK1/2及Caspase-3的表達水平。

1.2.5 統計學方法 采用SPSS12.0統計軟件。計量資料采用±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

各組脊髓組織神經元凋亡指數，SOD、MDA含量，Caspase-3、p-ERK1/2表達結果見表1。

表1 各組脊髓組織神經元凋亡指數、SOD、MDA、Caspase-3、p-ERK1/2比較 (±s)

表1 各組脊髓組織神經元凋亡指數、SOD、MDA、Caspase-3、p-ERK1/2比較 (±s)

注:與 S組比較，*P ＜0.05;與 I/R 組比較，△P ＜0.05;與 P組比較，#P ＜0.05

組別 n 凋亡指數(%) SOD［U/(g·prot)］ MDA［U/(g·prot)］Caspase-3 p-ERK1/2 S 組 8 2.76±0.25 312.25±19.56 1.02±0.21 39.22±15.30 29.32±11.53 I/R 組 8 45.43±5.15* 73.42±15.36* 7.62±0.33* 152.01±20.21* 82.01±21.32*P 組 8 17.24±3.63＊△ 179.76±16.33＊△ 3.66±0.58＊△ 107.45±19.16＊△ 192.82±29.71＊△PD 組 8 65.43±3.39*# 85.73±20.13*# 5.32±0.67*# 202.31±22.35*# 90.01±20.65*#

3 討論

研究證實，自由基損傷及其引發的脂質過氧化反應是導致神經系統缺血再灌注損傷的重要機制［4］。而脊髓組織膜結構含有豐富的脂質，易導致脊髓神經元的繼發性損害。SOD活性可反映氧自由基清除能力的高低，而MDA是目前公認的能較好反映機體內氧自由基水平及脂質過氧化損傷程度的間接指標。研究顯示，SOD、MDA測定可以反映缺血再灌損傷的嚴重程度［5］，缺血后控制性低壓處理也可以影響活性氧自由基的生成［6，7］。本研究中缺血再灌注組MDA含量明顯增多，SOD含量明顯減少，提示脊髓組織損傷較重;控制性低壓后處理組MDA含量下降、SOD含量上調，提示組織抗氧化能力增強，脊髓組織損傷減輕;而PD98059可以抑制控制性低壓后處理引起的抗組織氧化能力的增強。

ERK1/2是絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)家族中的一員，在將細胞外刺激信號轉導到細胞及其核內，并引起細胞生物學反應(如凋亡)的過程中具有至關重要的作用，是信號從細胞外轉到細胞內的傳遞者。ERK1/2活化引起細胞的增殖與分化［8］。活化的ERK1/2(p-ERK1/2)從胞質進入胞核，影響細胞功能狀態。一些學者認為，ERK1/2通路激活作用與適應、上調抗氧化因子轉錄等保護作用有關［9，10］。ERK1/2信號途徑與腦缺血后神經元存活有關［11］，其是否參與脊髓缺血再灌注損傷神經保護作用尚待進一步研究。前期實驗證實［3］，控制性低壓后處理促進ERK1/2蛋白的磷酸化，減少細胞凋亡。本研究中，缺血再灌注時脊髓組織p-ERK1/2表達上調，其原因可能與脊髓缺血再灌注期間微循環障礙，導致缺氧啟動修復有關;而缺血后控制性低壓處理使p-ERK1/2蛋白表達顯著上調，從而減輕脊髓缺血再灌注損傷。

Caspase家族是哺乳動物凋亡機制中的關鍵因素，其中Caspase-3被認為是此級聯反應中最具關鍵效應的凋亡蛋白酶，是缺血再灌注損傷的重要事件。正常情況下，胞質中Caspase-3以無活性酶形式存在，被凋亡信號激活后成為活性酶，活性的Caspase-3進一步切割不同底物，導致DNA裂解，最終使細胞走向死亡［12～16］。本研究發現，與缺血再灌注損傷組比較，控制性低壓后處理組Caspase-3蛋白表達明顯降低，而ERK1/2抑制劑PD98059阻斷了這種作用，提示缺血后控制性低壓后處理可通過ERK1/2途徑調控Caspase-3凋亡基因的表達。

綜上所述，控制性低壓后處理對脊髓缺血再灌注損傷具有保護作用，其機制可能與活化ERK1/2、抑制Caspase-3有關。

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