正常和癌變胃粘膜組織的共焦拉曼光譜初探＊

陳 瑤，代劍華，張 華，周學謙，劉云杰，彭貴勇*

(1.第三軍醫大學西南醫院全軍消化病研究所，重慶 400038;2.中國科學院重慶綠色智能技術研究院跨尺度制造技術重點實驗室，重慶 400714)

0 引言

胃癌是人類最常見的癌癥之一，在癌癥相關死亡率中位居第二。而胃癌的早期發現和預后密切相關。早期胃癌的5年存活率大于90%，而一旦有深層胃壁浸潤或有局部淋巴結累及，5年生存率降至20-30%［1-3?。因此早期發現在提高胃癌的存活率中具有重大意義。

胃癌的檢測主要依靠影像學及內窺鏡，診斷的金標準則是病理活檢。我們已知，影像學檢測大多都是在組織形態發生異常改變后才可以探測到，PET-CT(正電子發射計算機斷層顯像)雖然可以檢測組織細胞的代謝改變，但分辨率也只有4-7 mm，且假陽性較高，費用昂貴。內窺鏡下活檢部位的選擇依靠內鏡醫師的主觀判斷，且活檢有出血、轉移的風險。拉曼光譜可以對生物樣品進行實時、快速檢測，不受水的干擾，適用于體內活體診斷。不但對結構改變敏感，可以反映物質內部分子生化改變，且光譜圖簡單，譜峰銳利，利于分析。之前對乳腺癌、皮膚癌、喉癌等組織的拉曼光譜相關研究顯示，正常和癌變組織的拉曼光譜存在明顯差別［4-7?。本研究對正常和癌變粘膜組織的拉曼光譜進行分析研究，為拉曼光譜用于臨床檢測研究奠定基礎。

1 實驗材料和方法

1.1 拉曼光譜設備

激光共聚焦顯微拉曼光譜儀(RENISHAW):二極管激光器，激發波長785 nm，分辨率1-2 cm-1，最大激發光功率約300 mW，最大波譜范圍100-3200 cm cm-1，光柵:1200、1800、2400，并配置有高性能 Leica顯微鏡，XYZ三維樣品臺等。

1.2 標本收集

圖1 激光共聚焦顯微拉曼光譜儀(RENISHAW)Fig.1 Laser confocal microscope raman spectrometer

標本均來自2012-2013年于西南醫院行胃鏡檢查的患者。檢查前均取得患者知情同意并簽署相關知情同意書。本研究已通過倫理委員會的審查。共收集19例正常胃粘膜組織和12例胃癌粘膜組織。包括17男14女、平均年齡55.55±14.73歲，標本采集后立即置入1.8 mL凍存管封裝后置入冰塊中保存，帶至拉曼光譜實驗室檢測(標本檢測時離體時間約1 h)。各標本均經病理確診。

1.3 拉曼光譜測定

顯微共焦拉曼光譜儀參數設置:曝光時間20 s，累積次數2次，激發光功率30 mW，光柵1200，波普采集范圍800-1800 cm-1。測量前用硅片校準儀器。儀器校準后，將標本從凍存管中取出，平鋪于載玻片上，對每例標本隨機選取1個點進行采集，共獲得31個拉曼光譜圖(包括12個胃癌和19例正常)。激光共焦顯微拉曼光譜儀如圖1。

1.4 根據拉曼光譜原理及參考文獻總結人體組織拉曼光譜譜峰歸屬

當入射光與樣品分子發生能量交換(非彈性碰撞)則會產生頻率發生改變的散射光，即拉曼散射。入射光的頻率(v0)與散射光的頻率(vib)之差即拉曼位移(△v，△v=v0-vib)。對于同一物質，拉曼位移只和樣品分子的振動有關，與入射光的頻率無關(拉曼位移即波數=1 cm/v0-vib)［8］。拉曼位移頻率等于分子官能團的振動頻率。組成分子的各種官能團如 C=O、C-N、C=C、C-H、苯環等都有其各自特定的拉曼位移峰，分子其他部分對該峰的位置影響很小，這種有特定峰形或較高強度的峰，代表某種特定官能團存在，稱作官能團特征振動峰，峰所在的位置稱特征振動波數。參考文獻［9-18］，總結人體組織拉曼光譜譜峰歸屬。

1.5 數據處理及分析

所獲原始光譜數據均予以強度標準化、減掉基線背景等處理。并采用 spss、excell、NGS-Labspec等軟件分析處理。尋找胃正常和癌變粘膜組織的拉曼特征峰，計算特征峰平均位移、相對峰強比等。比較分析相對峰強，結合兩獨立樣本t檢驗，繪制ROC曲線等。

2 實驗結果

2.1 人體組織拉曼光譜譜峰歸屬

具體歸屬見表1。

表1 人體組織的拉曼光譜譜峰歸屬Tab.1 Raman peaks assignment of human tissues

2.2 正常和癌變胃粘膜組織的拉曼特征峰分析

本次研究所測得正常和癌變胃粘膜組織的全部光譜分別如圖2和3所示，平均光譜如圖4和5所示。由平均光譜分析可見，癌變胃粘膜的拉曼光譜發生了明顯改變。正常和癌組織中853 cm-1、939 cm-1、1004 cm-1、1128 cm-1處譜峰位置固定，表明測量前儀器校正準確，癌變組織的拉曼特征峰位移有意義。檢測所獲具體特征峰分布如下表2所示。由表可以看出，拉曼特征峰主要分布于800-1300 cm-1之間。除 1660 cm-1、1241 cm-1、1207 cm-1、1156 cm-1之外，正常胃粘膜組織特征峰相對強度大于胃癌。和正常相比，癌變胃粘膜中特征峰平均位移2.57 ±1.28 cm-1。除 829 cm-1、1800 cm-1發生了藍移(向低波數移動)之外，癌組織特征峰主要發生了紅移(與藍移相反)。而我們已知紅移主要是基團的活化、扭曲、吸附等，導致振動的能量減少;而藍移則表示振動的能量增加，可能是引入了新的基團或化學鍵，或是由于周邊的基團的活化，是其振動更加穩定。與正常組織相比，胃癌增加了特征峰1263 cm-1、1586 cm-1，同時減少了特征峰 956 cm-1、1172 cm-1。我們已知，這幾個特征峰均表征蛋白質，提示癌組織內部蛋白質組成發生了改變。

2.3 相對峰強比區分正常和癌變胃粘膜組織

所有光譜的I1087cm-1/I1207cm-1如下表3所示。采用兩獨立樣本的t檢驗，分析發現胃癌和正常胃粘膜相對強度比I1087cm-1/I1207cm-1在胃癌和正常胃粘膜組織中存在明顯差別(P＜0.05)，胃癌中 I1087cm-1/I1207cm-1≥1.87(平均值 1.05 ± 0.30)，而胃正常粘膜組織中 I1087cm-1/I1207cm-1＜1.87(平均值 0.39±0.09)。I1087cm-1/I1207cm-1區分胃癌和正常胃粘膜組織的準確率、靈敏度和特異度分別為87.1%、83.3%、89.5%，如圖6ROC曲線所示。

圖2 胃癌的拉曼光譜(n=12)Fig.2 Raman spectrums of gastric cancer(n=12)

圖3 胃正常粘膜組織的拉曼光譜(n=19)Fig.3 Raman spectrums of gastric normal tissues(n=19)

圖4 胃癌和胃正常粘膜組織的平均拉曼光譜Fig.4 Average Raman spectrum of malignant and normal gastric tissues

表2 正常和癌變胃粘膜的拉曼特征峰Tab.2 Characteristic raman peaks of normal and malignant gastric tissues

圖5 拉曼光譜(胃正常-胃癌，平均)Fig.5 Raman spectrum(gastric normal-cancer，average)

3 討論

胃癌的發生伴隨一系列生理生化代謝改變，如DNA解聚并大量復制、相關酶的合成等，其組分如蛋白質、脂質、核酸等大分子比例組成、內部化學鍵及分子之間官能團相互作用也隨之改變，從而引起拉曼光譜呈現出相應特征性改變。不僅可以通過癌變特征光譜區分正常和癌變，而且可以探索發現癌變的分子起源。目前胃粘膜癌變的拉曼光譜檢測分析逐漸引起研究者們的關注。代劍華等［19］提取正常胃粘膜、腸化胃粘膜、胃腺癌細胞基因組DNA進行拉曼光譜分析，推測三種細胞DNA的磷酸骨架鏈由穩定、不穩定發展到斷裂。Z Huang等［20］研究發現正常胃粘膜和異型增生胃粘膜的拉曼光譜有特征性差別，如特征峰1450 cm-1及1305 cm-1的相對峰強在異型增生的胃粘膜中明顯增加，I875cm-1/I1450cm-1作為診斷法則，鑒別異型增生和正常組織的靈敏度及特異度分別達到85.7%和80.0%。而我們已知胃粘膜癌變大都由異型增生發展而來。因此，我們對正常和癌變胃粘膜的拉曼光譜進行了初步分析研究。

表3 相對峰強比(I1087 cm-1/I1207 cm-1)Tab.3 Ratio of relative peak intensity(I1087 cm-1/I1207 cm-1)

圖6 ROC曲線來自于兩獨立樣本的t檢驗，曲線下面積為0.908，充分說明了I1087/I1207鑒別胃正常和癌變粘膜組織的有效性Fig.6 The receiver operating characteristic(ROC)curve generated from the two independent T-test，the integration area under curve(AUC)is 0.908，inllustrating the efficacy of I1087 cm-1/I1207 cm-1in differentiating malignant from normal gastric tissues

由此次研究中正常和癌變胃粘膜的拉曼光譜對比分析可以發現，在相同檢測條件下，胃癌的總體拉曼峰強度小于正常胃粘膜組織。我們已知胃癌組織血供豐富，而紅細胞富含卟啉，卟啉為強熒光物質，可能因此掩蓋了部分拉曼信號。

與正常胃粘膜組織相比，胃粘膜癌變后特征峰主要向高波數移動，即發生了紅移，振動能量降低。可能癌組織中分子內部化學鍵、官能團等有更多的振動模式，一致性降低，振動能量降低。提示組織細胞癌變中，不僅宏觀形態如組織形態、細胞排列、細胞核結構等發生了異常，其微觀組成如分子內部化學鍵、基團之間的相互作用等也發生了相應改變。進一步證實了拉曼光譜可以在分子生化水平跟蹤監測癌變。

特征峰1263 cm-1、1586 cm-1僅在胃癌組織中出現，而正常組織中不明顯。已知1263 cm-1來自于N-H的彎曲振動和C-H的伸縮振動［21］，表明某種蛋白質的構型構象發生了改變，導致某些氨基酸側鏈的暴露活化，出現了新的振動頻移位點;也可能是由于癌組織細胞活躍的增殖過程中合成了某種新的蛋白質。相反，特征峰1172 cm-1、955 cm-1僅在正常胃組織中出現，而在胃癌中這兩個特征峰不明顯。已知1172 cm-1主要是來自芳香族氨基酸的C-H面內彎曲振動［15］，提示胃癌組織中芳香族氨基酸與鄰近分子相互作用增強;也可能是胃癌組織中芳香族氨基酸含量減少。我們已知組織細胞內部蛋白質的含量及種類非常豐富，我們的研究結果提示癌組織中蛋白質的組成比例、種類、構型等發生了改變。表明拉曼光譜在探索分析癌變組織細胞內部如蛋白質、DNA等大分子物質的相對含量、結構特征、存在狀態中具有獨特的優勢。

由表3可見，與正常胃粘膜組織相比，I1087cm-1/I1207cm-1在胃癌中明顯大于正常組織。而我們已知，1087 cm-1表征核酸，1207 cm-1表征蛋白質，提示相對于蛋白質，核酸相對含量增加更明顯。反映了癌細胞有絲分裂活躍，核酸的含量明顯增加。在隨后深入的研究中，我們會增加樣本量，進一步證實這個結論。

本研究通過對比分析胃正常和癌變粘膜組織的拉曼光譜差異，結合統計學分析，區分胃正常和癌變粘膜組織，并初步探索癌變相關的分子生化改變，主要結果如下:1.和正常相比，胃癌組織的拉曼特征峰主要向高波數發生位移，提示胃癌組織內部分子化學鍵或官能團的振動模式多樣化。2.特征峰1263 cm-1和1586 cm-1僅在胃癌中出現，正常組織中不明顯;與此相反，955 cm-1僅在正常組織中出現，而胃癌中不明顯。提示胃癌組織內部大分子物質如蛋白質等的相對含量、構型構象、存在狀態等發生了改變。3.相對峰強比I1087cm-1/I1207cm-1在胃癌和正常胃粘膜組織中存在明顯差別(P＜0.05)，胃癌中 I1087cm-1/I1207cm-1≥1.87，其鑒別胃癌和正常胃粘膜組織的準確率、靈敏度和特異度分別高達87.1%、83.3%、89.5% 。

因此，拉曼光譜檢測胃癌和正常胃粘膜組織，不僅可通過相對峰強比等鑒別癌變，還可通過光譜探索癌變組織細胞內部的分子生化改變。提示拉曼光譜在胃癌的跟蹤監測、臨床診斷和基礎研究中具有良好應用前景。

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