冬蟲夏草口服液微生物限度檢查方法學驗證

馮 旭，汪家春，趙 龍，陳 虹，刁 琢，儲智勇

·論著·

冬蟲夏草口服液微生物限度檢查方法學驗證

馮 旭，汪家春，趙 龍，陳 虹，刁 琢，儲智勇

目的 建立冬蟲夏草口服液微生物限度檢查方法，并對方法進行驗證。方法 采用常規法，通過大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念球菌、黑曲霉5種陽性菌回收率試驗進行細菌、霉菌和酵母菌計數方法的驗證，同時對控制菌檢查方法進行驗證。結果 采用常規法計數細菌、霉菌及酵母菌時，各試驗菌回收率在70%以上;控制菌檢查中，各陽性試驗菌均檢出，陰性對照無菌生長。結論 可以采用常規法進行冬蟲夏草口服液的微生物限度檢查。

冬蟲夏草口服液;微生物限度檢查;方法驗證

冬蟲夏草口服液是由中國人民解放軍海軍醫學研究所研制，以野生冬蟲夏草及人工培養冬蟲夏草菌絲體為原料生產的口服液制劑，具有滋陰補陽、益氣補血的功效，可用于腫瘤患者放療、化療的輔助治療。根據《中國藥典》2010年版(一部)微生物限度檢查法規定，在建立藥品的微生物限度檢查法時，應進行細菌、霉菌及酵母菌計數方法和控制菌檢查方法的驗證，以確認所采用的方法適合于該藥品的細菌、霉菌及酵母菌數的測定和控制菌檢查［1］。為更好地保證冬蟲夏草口服液的安全性和療效，本實驗對冬蟲夏草口服液進行了微生物限度檢查的方法驗證。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藥品和培養基

冬蟲夏草口服液(規格:10 ml/瓶，海軍醫學研究所，批號:20130402、20130301、20130109);營養瓊脂培養基、營養肉湯培養基、玫瑰紅鈉瓊脂培養基、改良馬丁瓊脂培養基、膽鹽乳糖增菌培養基、4-甲基傘形酮葡糖苷酸蛋白胨培養基(MUG)、蛋白胨均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 菌株

大腸埃希菌(Escherichia coli)［CMCC(B) 44102］，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)［CMCC(B)26003］，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)［CMCC(B)63501］，白色念珠菌(Candida albicans)［CMCC(B)98001］，黑曲霉(Aspergillus niger)［CMCC(B)98003］均購自上海食品藥品檢驗所。

1.1.3 儀器

恒溫培養箱，生化培養箱，電子天平，高壓蒸汽滅菌器，凈化工作臺，三用紫外分析儀。

1.2 方法

1.2.1 供試液和菌液的制備

按文獻［2］制成1∶10的供試液備用。按文獻［2］制備大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和黑曲霉的菌懸液，50～100 cfu/ml。

1.2.2 細菌、霉菌及酵母菌回收率檢測

1.2.2.1 驗證方法 采用平皿法，每個菌種的計數方法驗證分為供試品試驗組、菌液組、供試品對照組和稀釋劑對照組。(1)供試品試驗組:取1∶10供試液1 m l，及各50～100 cfu的試驗菌1 ml，分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養基。大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌傾注營養瓊脂培養基;白色念珠菌、黑曲霉傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基。(2)菌液組:取上述制備菌液各1 m l注入平皿中，傾注相應的瓊脂培養基。(3)供試品對照組:取上述1∶10供試液1 m l注入平皿中，傾注相應的瓊脂培養基。(4)稀釋劑對照組:取pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液1 m l及各50～100 cfu的試驗菌1 m l，分別注入平皿中，傾注相應的瓊脂培養基。將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌在34℃下培養48 h，將白色念珠菌、黑曲霉在27℃下培養72 h，點計菌落數。計算回收率，試驗組菌數回收率=(試驗組的平均菌落數－供試品對照組的平均菌落數)÷菌液組的平均菌落數×100%，稀釋劑對照組菌數回收率=(稀釋劑對照組的平均菌落數÷菌液組的平均菌落數)×100%。

1.2.2.2 樣品細菌、霉菌及酵母菌計數檢查 取批號為20130402、20130301、20130109的樣品各10 ml，分別加pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋至100 ml，作為1∶10的供試液。取1∶10供試液10ml，加pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋至100 ml，作為1∶100的供試液。吸取各稀釋級供試液各1 ml至無菌平皿中，每一稀釋級每種培養基至少注2～3個平皿，細菌計數使用營養瓊脂培養基，霉菌、酵母菌計數使用玫瑰紅鈉瓊脂培養基。另取4 ml試驗用稀釋劑(pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液)分別注入4個平皿中(即1 ml/皿)，其中2個作細菌數陰性對照，另2個作霉菌、酵母菌數陰性對照。混勻，細菌計數平板倒置于34℃培養箱中培養3 d，霉菌、酵母菌計數平板倒置于27℃培養箱中培養5 d。

1.2.3 控制菌檢查方法的驗證

1.2.3.1 菌種選擇 冬蟲夏草口服液為中藥口服液體制劑，不含生藥原粉，按《中國藥典》2010年版附錄微生物限度檢查法中的有關控制菌檢查方法，應檢查大腸埃希菌，陰性對照菌為金黃色葡萄球菌。

1.2.3.2 菌液和供試液的制備 菌液按“1.2.1”方法制備，菌數控制在10～100 cfu/ml。供試液按“1.2.1”方法制備。

1.2.3.3 驗證方法 取1∶10供試液10 ml加入到100 ml膽鹽乳糖培養基中，再加入10～100 cfu大腸埃希菌懸液作為試驗組;取1∶10供試液10 ml加入到100 ml膽鹽乳糖培養基中，再加入10～100 cfu金黃色葡萄球菌懸液作為陰性菌對照組;取1∶10供試液10 ml加入到100 ml膽鹽乳糖培養基中作為供試品對照組，在34℃培養18～24 h。取上述各培養物0.2 m l，接種至含5 m l MUG培養基的試管內培養，于5、24 h在366 nm紫外光下觀察，同時用未接種的MUG培養基作本底對照，若管內培養物呈現熒光，為MUG陽性，若不呈現熒光，為MUG陰性。

2 結果

2.1 細菌、霉菌及酵母菌回收率結果

采用常規法檢查冬蟲夏草口服液對5株菌的抑菌活性，結果試驗組菌數回收率均＞70%，說明本品無明顯抑菌活性，可用常規法進行微生物限度檢查。見表1。

2.2 樣品細菌、霉菌及酵母菌計數檢查結果

結果表明，20130402、20130301、20130109 3批樣品按驗證方法檢查，細菌、霉菌或酵母菌總數均小于10 cfu/ml，符合規定。

2.3 控制菌檢查法驗證結果

觀察后，沿管壁加入數滴靛基質試液，液面呈玫瑰紅色為靛基質陽性，呈試劑本色為靛基質陰性。結果顯示，控制菌檢查陽性菌生長良好，陰性菌均未檢出，說明冬蟲夏草口服液對大腸埃希菌沒有抑制作用，可用常規法進行檢驗。見表2。

表1 常規法各查得試驗菌株的回收率(%)

表2 各組控制菌檢查法驗證結果

3 討論

中國藥典2010年版微生物限度檢查法中規定:微生物限度檢查回收率試驗中，若試驗組的菌回收率均不低于70%，照該供試液制備方法和計數法測定供試品的細菌、霉菌及酵母菌的菌數。本實驗采用常規法對冬蟲夏草口服液進行細菌、霉菌及酵母菌數測定，大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉的回收率試驗均高于70%，說明可直接采用常規法對冬蟲夏草口服液進行細菌、霉菌及酵母菌數的計數。

在控制菌檢查試驗中，試驗組檢出大腸埃希菌，陰性菌對照組未檢出金黃色葡萄球菌，說明常規法可用于冬蟲夏草口服液的控制菌大腸埃希菌檢查。因此，可以直接采用常規法對冬蟲夏草口服液進行微生物限度檢查。

［1］ 國家藥典委員會.中國藥典:第一部［M］.北京:中國醫藥科技出版社，2010:79-88，138.

［2］ 中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗標準操作規范［M］.北京:中國醫藥科技出版社，2010:351-407.

［3］ 何進，顧明業，高軍，等.桃紅四物口服液微生物限度檢查的方法驗證［J］.解放軍藥學學報，2010，26(4):371-373.

［4］ 許華玉，杜蕓，錢文靜.藥品微生物限度檢查法中細菌和真菌計數方法的驗證試驗［J］.中國中藥雜志，2005，30(24): 1918-1920.

Verification ofm icrobial lim it test for the Cordyceps sinensis oral liquid

FENG Xu，WANG Jia-chun，ZHAO Long，CHEN Hong，DIAO Zhuo，CHU Zhi-yong

(Naval Medical Research Institute，Shanghai200433，China)

Objective To establish amethod ofmicrobial limit test for Cordyceps sinensis oral liquid and to verify the validity of the testingmethod.Methods Conventionalmethodswere used to verify the countingmethods formicrobial，fungus and yeast counts through themeasurement of the recovery rates of5 positive bacteria in the Cordycepssinensis oral liquid.At the same time，the detection method for the control bacteria in the Cordyceps sinensis oral liquid was also verified.Results When conventional detection methods were used，the recovery rates of various bacteriawere over70%.In the detection of the control bacteria，positive testbacteriawere all detected，while no bacterial growth was detected in the control.Conclusion Conventionalmethods could be used for the detection of microbial limit in the Cordyceps sinensis oral liquid.

Cordyceps sinensis oral liquid;Microbial limit test;Verification of themethod

R284.1

A

10.3969/j.issn.1009－0754.2014.06.003

2014－02－06)

(本文編輯:張陣陣)

全軍醫藥衛生科技基金(14TG0295)

200433 上海，海軍醫學研究所(馮旭、汪家春、儲智勇);天津科技大學(趙龍、陳虹、刁琢)

儲智勇，電子信箱:zhiyongchuleader@163.com