大豆異黃酮對骨質疏松大鼠種植體骨結合療效的評價*

張春光 晁 洋 宋 揚 王慧媛 高菊榮

骨質疏松癥是一種以全身骨量減少、骨組織破 壞為特征而導致骨脆性增加、骨折發生率增高的全身性骨骼疾病。尤其在絕經期后婦女中，這種原發性的骨質疏松癥已成為影響婦女健康的嚴重問題。雌激素水平降低，骨的快速丟失導致骨質疏松癥，是絕經后骨質疏松發病的重要原因。絕經后婦女骨質疏松發病率是同齡男性的6 倍，而骨質疏松又是口腔種植的相對禁忌癥。因此，促進骨質疏松癥患者種植體骨結合成為廣大科研和臨床工作者的研究目標。去卵巢大鼠是模擬絕經后婦女骨質疏松最成熟的動物模型[1]，本研究選取4 月齡的雌性SD 大鼠進行卵巢切除造成骨質疏松癥大鼠模型，并使用大豆異黃酮這種對絕經期后骨質疏松癥治療廣泛使用的藥物，比較不同劑量的大豆異黃酮對骨質疏松癥大鼠的種植體骨結合的影響， 以大鼠種植體骨結合率、松質骨螺紋區骨面積為指標，采用骨組織形態計量學手段，來研究不同劑量的大豆異黃酮對骨質疏松狀態下種植體骨整合的影響，并使用抗扭力脫位測試種植體骨結合的實際效果，為其臨床應用提供依據。

1. 材料與方法

1.1 實驗用品及儀器 純鈦種植體：5mm×2mm 螺紋柱狀光滑純鈦螺釘(西安中邦鈦制品有限公司)；大豆異黃酮(陜西錦泰生物工程有限公司)；扭矩測試儀(HP-10，廣東質信電子有限公司)；微型馬達(LX-30FS，日本)；Olympus 多功能顯微鏡(TPH4-200，日本)；專業圖像分析軟件(Image-pro Plus 版本6.0)。

1.2 實驗方法

1.2.1 骨質疏松動物模型的建立 4 月齡SD雌性大鼠，戊巴比妥鈉麻醉后，在無菌條件下行雙側卵巢切除手術。經腹背部肋緣下1cm，脊柱兩側各1.5cm 交界處，分別做1cm 左右切口進入腹腔，結扎并切除雙側卵巢，術后肌注40 萬單位青霉素預防感染。假手術組不切除卵巢，只切除卵巢附近少量脂肪組織。

1.2.2 種植手術 卵巢切除手術后10 周，對所有實驗動物進行種植手術。戊巴比妥鈉麻醉后，在大鼠雙側股骨遠中干骺端分別植入純鈦螺紋釘1顆。

1.2.3 標本的獲取 于種植手術后12 周處死實驗大鼠，取其股骨遠中段包含種植體的骨組織，用10%甲醛溶液固定送檢。

1.3 實驗動物及分組 4 月齡SPF 級雌性SD 大鼠40 只，由第四軍醫大學實驗動物中心提供。飼養環境為清潔級，每5 只大鼠分一籠，室溫25℃，相對濕度60%-80%，自由飲食。按照大鼠體重排序后隨機區組分組方式共分為4 組：

Ⅰ，假手術組(Sham-ovariectomized rats，SHAM)：10 只，切除雙側卵巢旁等量脂肪組織后即縫合創口，未植入鈦螺紋釘。

Ⅱ，卵巢切除組(OVX)：10 只，行雙側卵巢切除手術。10 周后在實驗動物雙側脛骨干骺端分別植入鈦螺紋釘1 顆。

Ⅲ，卵巢切除+ 低劑量大豆異黃酮組(OVX+SIL)：10 只，行雙側卵巢切除手術。10 周后在實驗動物雙側脛骨干骺端分別植入鈦螺紋釘1顆。植入鈦螺紋釘后使用SI 藥物灌胃12 周，灌胃劑量為60mg/ kg。

Ⅳ，卵巢切除+ 高劑量大豆異黃酮組(OVX+SIH)：10 只，行雙側卵巢切除手術。10 周后在實驗動物雙側脛骨干骺端分別植入鈦螺紋釘1顆。植入鈦螺紋釘后使用SI 藥物灌胃12 周，灌胃劑量為120mg/ kg。

1.4 檢測指標及方法 實驗開始第20 周后，處死全部大鼠并取材。每只實驗大鼠左側股骨樣本進行生物力學扭矩測試，右側股骨樣本進行硬組織切片染色后行骨組織形態計量學檢測。

1.4.1 生物力學扭矩測試 將帶種植體的左側脛骨標本，修整為15mm 長，使其能恰當卡入扭矩測試儀特制的夾具，扭力扳手固定在種植體頭部外露部分。沿逆時針方向用力，記錄種植體脫位松動前的最大載荷值。

1.4.2 骨組織形態定量學檢測 將帶種植體的右側脛骨標本，送樣進行非脫鈣骨硬組織切片，將切片進行亞甲基藍-堿性品紅染色后常規封片。將染色切片置于顯微鏡下進行觀察并拍照，使用Image-pro Plus 軟件在大倍率視圖下：①標出種植體外形輪廓線，測量輪廓線中有骨結合的部分的長度和總長度，計算出種植體骨結合率(Bone Contact Ratio of the implant，BCR)。②標出種植體的兩個螺紋外形最外點，以該兩點相連的長度為邊長向骨內區域畫出一正方形，計算該區域面積中礦化骨基質的面積所占百分比，計算出松質骨區骨量(Trabercular Area，TA)。

1.5 統計學方法 多標本均數間的比較采用隨機區組設計資料的方差分析，計算結果以±s形式表示，檢驗水準α=0.05，P＜0.05 有統計學意義。使用SPSS 16.0 軟件進行統計分析。

2. 結果

2.1 實驗大鼠狀況 去卵巢手術、種植體植入手術后至處死前，各組大鼠狀況均良好，卵巢切除及種植術后，所有大鼠創口愈合佳，無感染。

2.2 種植體生物力學扭矩測試 OVX+SIH組的脫位扭矩與SHAM 組無顯著性差異(P＞0.05)。其余各實驗組扭矩值均較SHAM 組低，且P＜0.05(見表1)。

2.3 骨組織形態定量學檢測 SHAM 組及OVX+SIH 、OVX+SIL 組的松質骨區骨量、骨結合率均明顯高于OVX 組，比較差異有顯著性(P＜0.05)。其中，OVX+SIH 組的松質骨區骨量、骨結合率均比OVX+SIL 組高，比較差異有顯著性(P＜0.05)(見表2)。

2.4 光鏡下觀察種植體-骨結合組織切片形態 SHAM 組皮質骨區的種植體骨結合界面骨板密集，骨與種植體結合緊密。松質骨區種植體表面包繞骨質較厚，連續性較好。松質骨區骨小梁密集而連續，粗細均勻成網狀(見圖1A)。

OVX 組皮質骨區種植體骨結合界面骨板較薄，連續性較差。松質骨區種植體表面大部分在骨髓腔內未與骨組織接觸，周圍有少量成團的礦化組織，骨小梁稀疏(見圖1B)。

OVX+SIH、OVX+SIL 組皮質骨區種植體骨結合界面緊密接觸，結合骨板連續性較好。松質骨區包繞種植體的骨板厚度增加，排列成板狀。骨松質區骨小梁比較粗大基本連接成網狀，介于以上兩組之間。OVX+SIL 與OVX+SIH 比較，皮質骨區未見明顯區別，但骨小梁區排列欠規則，骨小梁較薄(見圖1C、D)。

表1 各組大鼠種植體脫位扭矩分析(N·cm)(±s，n=10)

表1 各組大鼠種植體脫位扭矩分析(N·cm)(±s，n=10)

注：△與OVX 組比較P＜0.05； ▲與OVX+SIL 組比較P＜0.05；☆與sham 組比較P＞0.05

組別 脫位扭矩 扭矩范圍Sham 組 21.2±3.5 18～24 OVX 組 12.5±2.7 9～15 OVX+SIL 組 16.6±3.1△ 13～20 OVX+SIH 組 19.8±2.9▲☆ 17～22

3. 討論

越來越多的老年骨質疏松癥患者尋求種植牙修復缺失牙齒，但骨質疏松癥患者種植牙的高失敗率使大量患者的需求難以滿足。國內外目前的研究顯示，骨質疏松癥對口腔種植的影響主要表現在種植區骨量減少、骨質量變差和降低種植體骨結合率這兩方面。

表2 各組大鼠種植體骨結合情況(%)(±s，n=10)

表2 各組大鼠種植體骨結合情況(%)(±s，n=10)

注：△與OVX 組比較P＜0.05；▲與OVX+SIL 組比較P＜0.05；☆與sham 組比較P＜0.05

組別 骨結合率 松質骨區骨量Sham 組 78.63±2.92 36.52±2.38 OVX 組 43.82±1.72 19.73±2.63 OVX+SIL 組 57.35±2.16△ 24.29±1.97△OVX+SIH 組 71.91±3.36▲☆ 32.83±1.64▲☆

圖1 硬組織切片染色(×10)

國內外有許多學者實驗證實，使用雌激素替代療法可以使骨質疏松癥動物體內的種植體的骨結合更加緊密，李曉紅等[2]使用雌激素和鈣制劑，對骨質疏松大鼠模型種植體界面骨愈合影響的實驗顯示出，骨質疏松癥降低了種植體和骨界面的早期骨愈合程度，而雌激素治療或者雌激素和鈣聯合治療都能增加種植體周圍骨的形成。雖然雌激素替代療法對骨質疏松癥有較好療效，但其對乳腺和子宮等靶器官的不良影響也日益受到重視[3]。

大豆異黃酮由金雀異黃素(染料木黃酮)和大豆苷原兩種類雌激素物質組成，是一種典型的植物雌激素[4]。其結構與雌激素相似，具有弱雌激素樣作用，可防治骨質疏松癥尤其是絕經期婦女的骨質疏松癥[5]，且對乳腺、子宮等器官無不良影響[6]。國內外的流行病學調查發現，東方女性的膳食中豆類食物的比重遠遠大于西方女性，前者的骨折發生率也顯著低于后者[7]。之后的很多研究把大豆異黃酮作為雌激素替代物防治絕經后骨質疏松癥。Arjmandi 等[8]的研究報道大豆蛋白可抑制去卵巢模型大鼠的股骨及腰椎骨的骨密度降低， 并證實大豆異黃酮是大豆蛋白發揮抗骨質疏松作用的有效成分。Ishida 等[9]報道大豆異黃酮中DAI 和GEN 成分可有效防止骨質疏松模型大鼠股骨骨密度、強度、灰重及鈣磷含量的下降。后來， Ishimi 等[10]研究發現GEN 可抑制OVX 小鼠的骨丟失而沒有出現作用于子宮的雌激素樣作用。

在本次實驗動物中，OVX 組不僅種植體骨結合率、松質骨螺紋區骨面積低于SHAM 組，而且骨小梁形態很差，種植體周圍結合骨板量非常少，從而減弱了骨組織對種植體的支持，使種植體的抗脫位扭矩與SHAM 組有較大差距。OVX+SIL 組組織學觀察示：皮質骨區和松質骨區種植體都與較多的骨組織接觸，只有部分與骨髓腔直接相連，達到了較好的骨結合狀況。通過給藥量的增加，OVX+SIH 組的組織學觀察己經與SHAM 組相似，皮質骨區和松質骨區種植體都與礦化良好的板狀骨組織緊密接觸，種植體在骨髓腔部分也被骨板包繞，雖然骨計量學檢測與SHAM 組相比有顯著性差異，但通過生物力學扭矩測試，兩組已無顯著性差異，達到了良好的骨結合狀況。

綜合以上結果說明，大豆異黃酮有劑量依賴性地改善種植體周圍骨質量的可能性，大豆異黃酮可以有效改善種植體周圍骨質量，增強骨質疏松大鼠鈦螺紋釘的骨結合強度，增強疏松狀態下種植體的穩定性，并存在劑量依賴性。

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[2] 李曉紅，任 輝，唐衛峰. 雌激素及鈣劑對去勢大鼠種植體界面骨愈合影響的相關研究[J]. 中國口腔種植學雜志， 2006，11(4):151-154， 157

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[8] Arjmandi B H， Birnbaum R， Goyal N V， et al. Bone-sparing effect of soy protein in ovarian hormone-deficient rats is related to its isoflavone content[J]. Am J Clin Nutr， 1998，68(6 Suppl):1364S-1368S

[9] Ishida H， Uesugi T， Hirai K， et al. Preventive effects of the plant isoflavones， daidzin and genistin， on bone loss in ovariectomized rats fed a calcium-deficient diet [J]. Biol Pharm Bull， 1998，21(1):62-66

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