耳針、中藥對衰老大鼠海馬神經元NGF、BDNF蛋白表達的影響

劉億淑 呂明莊

摘要：目的：通過觀測耳針、六味地黃丸加味丹參對D-半乳糖衰老大鼠海馬組織神經生長因子（NGF）、腦源性神經營養因子（BDNF）的蛋白表達的影響，探討耳針、六味地黃丸加味丹參預防和延緩衰老的可能機理，為耳針、中藥延緩衰老在臨床上的運用提供新的理論和實驗依據。結果：：1、耳針組、中藥組、耳針+中藥組海馬組織NGF蛋白表達增加，與模型組相比較，差異具有顯著性（P<0.01或P<0.05）。其中耳針+中藥組與耳針組、中藥組比較，差異有顯著性（P<0.01）；耳針組與中藥組比較，差異無顯著性（P>0.05）。2、耳針組、中藥組、耳針+中藥組海馬組織BDNF蛋白表達增加，與模型組相比較，差異具有顯著性（P<0.01或P<0.05）。其中耳針+中藥組與耳針組、中藥組比較，差異有顯著性（P<0.01）；耳針組與中藥組比較，差異無顯著性（P>0.05）。結論：耳針、中藥具有延緩衰老的作用，從神經內分泌角度看，其可能的作用機理是：耳針、中藥促進內源性神經生長因子（NGF）、腦源性神經營養因子（BDNF）的表達，發揮其營養、支持、保護神經細胞、抑制細胞凋亡的作用，從而調節神經內分泌系統功能最終達到延緩衰老的目的。

關鍵詞：衰老； 耳針；中藥； 海馬； 神經生長因子； 腦源性神經營養因子

【中圖分類號】R453【文獻標識碼】 A【文章編號】1002-3763（2014）09-0071-02目前全球都面臨人口老齡化問題，老年人口的增多帶來了一系列社會和經濟問題。因此，對衰老機制和延緩衰老的研究日益受到重視，其中神經系統的老齡性退行性變化引起的疾病，如老年癡呆、帕金森病等已成為醫學領域中研究的熱點，受到普遍關注。本研究采用D-半乳糖致衰老的方法復制衰老大鼠模型，以海馬神經元神經營養素家族成員神經生長因子（NGF）、腦源性神經營養因子（BDNF）的表達以及雌鼠血清非肽類神經生長因子雌激素（E2）的含量作為檢測指標，探討耳針、中藥預防和延緩衰老的可能途徑，探索其延緩衰老作用的新機制，為耳針、中藥延緩衰老在臨床上的運用提供新的理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料：

1.1.1 動物：Wistar健康大鼠70只，清潔級，雌雄各半，雙耳無缺損，3～4月齡，體重250～300g（由貴陽醫學院實驗動物中心提供），造模前在相同光照條件大鼠適應性喂養1周，雌雄分開，自由攝取標準飼料（由貴陽醫學院實驗動物中心提供），飲用干凈自來水，室溫控制在15～18℃之間，濕度70%左右。

1.1.2 主要試劑和儀器：六味地黃丸：貴陽德昌祥藥業有限公司；丹參：貴陽阜康堂藥業公司；SOD試劑盒：南京建成生物工程有限公司；MDA試劑盒：南京建成生物工程有限公司

BDNF免疫組化試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司；NGF免疫組化試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司；撳針（耳針）：北京環亞醫藥器械公司；臺式高速離心機：上海醫用分析儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組：70只 Wistar健康大鼠隨機分為5組，每組14只（雌雄各半，分開飼養），即對照組、模型組、耳針組、中藥組、耳針+中藥組。

1.2.2 動物模型建立[1]：Wistar大鼠適應性喂養1周后，采用國際上公認的D-半乳糖復制衰老模型。6周后，取大鼠靜脈血測血清超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量。模型組與對照組比較，模型組SOD活性明顯降低，MDA含量明顯增高（見表1、2），證明模型復制成功。

1.3 治療方法

1.3.1 耳針組：在造模同時進行耳針治療，根據華興邦《實驗動物與動物實驗》中及林文注[2] 、李辭蓉[3]所介紹的動物穴位定位，選取大鼠雙側耳穴（腎穴、脾穴、肝穴）以撳針按壓后固定留置于耳上。

1.3.2 中藥組：在造模同時每日給予六味地黃丸（由熟地、山藥、山萸肉、茯苓、澤瀉、牡丹皮組成）加丹參磨制成中藥粉末，每只大鼠每日按成人劑量的10倍給藥，拌入飼料后混勻，自由攝食。

1.3.3 耳針+中藥組：造模同時進行耳針+中藥治療，取穴及中藥喂服方法同前。以上治療時間均為6周[1]。

1.4 指標及檢測

1.4.1 血清SOD、MDA的檢測

血清SOD、MDA的檢測均按試劑盒說明書操作。SOD的活性采用黃嘌呤氧化酶法檢測； MDA的含量采用硫代巴比妥酸（TAB）法檢測。

1.4.2 NGF、BDNF的免疫組織化學染色，

1.4.3 免疫組化染色陽性結果判斷：陽性信號主要位于胞漿內，呈棕黃色或黃色者為陽性細胞。

1.4.4 數據處理及圖像分析：數據采用SPSS12.0統計軟件進行儲存、整理、分析，各項指標采用均數±標準差表示，組間數據采用單因素方差分析及q檢驗。

圖像資料采用貴陽醫學院病理科Biomias99圖像分析系統。取視場面積443268um2，每張切片在顯微鏡的10×40倍目鏡下隨機選5個視場，通過攝像頭采集圖像進入Biomias99圖像分析系統，每個視場內選取5個陽性表達區域進行光密度（OD）測定，取其平均值即為該切片的平均光密度。所有OD值測量均在相同光學、光源條件下完成。用鼠標點擊法計數陽性（表達）細胞。記錄各組海馬區NGF和BDNF的陽性細胞數及其表達的平均光密度值。

2 結果

2.1 一般情況觀察結果：對照組大鼠毛發光澤、順滑，皮膚彈性好，行動敏捷，自主活動佳，大便成形，呈黃褐色，無腥臭。模型組大鼠毛發枯黃、無光澤，皮膚粗糙、彈性差，行動遲緩，自主活動明顯降低，大便較稀，較為腥臭。其余治療組大鼠上述表現較模型組均見良性逆轉。

2.2 各組大鼠血清超氧化物歧化酶（SOD）活性的變化（見表1）

表1 各組大鼠血清SOD活性的比較（X±S）

Tab-1 The Comparison of Serum SOD Activity among Groups（X±S）

組 別 例 數 SOD（NU/ml）對 照 組13659.15±126.33模 型 組12 314.65±118.49 #耳 針 組14553.12±61.80*中 藥 組14553.02±83.38*耳針+中藥組14 606.31±73.12*△▲注：與對照組比較 # ：P<0.01 與模型組比較 * ：P<0.05

與耳針組比較 △：P<0.05 與中藥組比較 ▲：P<0.05

表2 各組大鼠血清MDA含量的比較（X±S）

Tab-2 The Comparison of Serum MDA Content among Groups（X±S）

組 別 例 數 MDA（nmol/ml）對 照 組130.65±0.40模 型 組122.03±0.68#耳 針 組141.15±0.44*中 藥 組141.40±0.31*耳針+中藥組14 0.64±0.31*△▲注：與對照組比較 # ：P<0.001 與模型組比較 * ：P<0.05

與耳針組比較 △：P<0.01 與中藥組比較 ▲：P<0.01

由表2統計結果表明：與對照組比較，模型組血清MDA含量顯著升高（P<0.001）；耳針組、中藥組、耳針+中藥組與模型組比較，血清MDA含量均有明顯降低（P<0.05）；三個治療組間兩兩比較，耳針+中藥組MDA含量低于耳針組、中藥組（P<0.01）；耳針組、中藥組間差異無顯著性（P>0.05）。

2.3 各組大鼠血清丙二醛（MDA）含量的變化（見表2）

2.4 海馬組織神經營養因子（NGF）免疫組織化學染色結果（見表3）

由表1統計分析表明：與對照組比較，模型組血清SOD活性顯著降低（P<0.01）；耳針組、中藥組、耳針+中藥組與模型組比較，血清SOD活性均有明顯升高（P<0.05）；三個治療組間兩兩比較，耳針+中藥組SOD活性高于耳針組、中藥組（P<0.05）；耳針組、中藥組間差異無顯著性（P>0.05）。

表3 各組NGF免疫陽性細胞數目和平均光密度比較（X±S）

Tab-3 The comparison of amount of Immunal positive cell and meaning of lingt density of NGF among groups （X±S）

組 別例 數 陽性細胞數 平均光密度對 照 組818.51±1.7288.99±3.17模 型 組82.42±1.16#185.74±9.81#耳 針 組810.89±1.18*140.60±3.44*中 藥 組810.66±1.16*140.21±3.44*耳針+中藥組816.22±1.48*△▲93.24±3.41*△▲注：與對照組比較 # ：P<0.01 與模型組比較 * ：P<0.05

與耳針組比較 △：P<0.01 與中藥組比較 ▲：P<0.01

2.5 腦源性神經營養因子（BNGF）免疫組織化學染色結果（見表4）

表4 各組BDNF免疫陽性細胞數目和平均光密度比較（X±S）

Tab-4 The comparison of amount of Immunal positive cell and meaning of lingt density of BDNF among groups （X±S）

組 別例 數 陽性細胞數 平均光密度對 照 組819.6±1.5294.44±4.38模 型 組8 2.47±1.27#192.69±3.94#耳 針 組8 8.93±1.31*152.30±3.13*中 藥 組89.45±1.06*151.92±2.88*耳針+中藥組815.23±1.42*△▲116.04±2.35*△▲注：與對照組比較 # ：P<0.01 與模型組比較 * ：P<0.05

與耳針組比較 △：P<0.01 與中藥組比較 ▲：P<0.01

3 討論

衰老的神經內分泌調節學說認為，機體在神經系統的控制下，通過神經內分泌的調節，完成其生長、發育、成熟、衰老乃至死亡這一系列生物過程。神經內分泌調節各個環節的增齡性衰退變化，都將加速衰老過程。有實驗研究顯示[4-8]，老年癡呆、帕金森病、亨廷頓氏舞蹈癥等老年性退行性疾病的發生、發展可能與缺乏神經營養家族（NTs）成員如NGF、BDNF的營養作用有關。

現代研究認為[9]，耳針對機體的作用是神經體液綜合調節的結果。針刺或貼壓耳穴可調節臟腑和器官功能活動，提高機體免疫功能，改善腎虛，改善激素水平，從而達到延緩衰老的目的[10]。本研究根據辨證選穴原則，選取耳穴“腎”、“脾”、“肝”。“腎”穴具有培補腎氣、填精補髓、培元固本的作用，“脾”穴能養胃健脾、益氣輸津，“肝”穴具有調暢氣機、活血化瘀的作用，三穴共奏扶正祛瘀之功，以達延緩衰老之效。

大量的動物實驗和臨床研究發現，六味地黃丸具有抗氧化、抗腫瘤、增強免疫功能、改善微循環、提高應激能力、延長機體生存壽命、延緩衰老等功能[11-14]。此外，現代醫學還利用基因芯片技術發現[15]，六味地黃丸可調節相關基因的表達水平，從而調節機體功能，起到延緩衰老的作用。丹參有很強的抗氧化作用，能消除自由基，增強機體的抗氧化能力，能保護DNA，上調bcl-2表達 ，對神經細胞凋亡有明顯的抑制作用[16]。此外，丹參提取物可有效改善氧化衰老模型小鼠的免疫狀態[17]。

本研究提示耳針、中藥延緩衰老的機制可能是：耳針、中藥能促進海馬組織內源性NGF、BDNF表達，發揮其對神經元細胞的營養、支持和保護作用，延緩神經系統的老齡性改變，調節神經內分泌系統功能，從而起到扶正化瘀、調節陰陽、疏經通絡、調整臟腑功能的作用，最終達到延緩衰老目的。同時，本實驗還發現，耳針+中藥組各項指標均優于耳針組和中藥組，且差異具有顯著性，說明耳針與中藥具有協同作用，這可能與耳針、中藥共同發揮了增強免疫、調節自由基、調節脂代謝、改善激素水平等功能有關。

參考文獻

[1]梁欣，耳針、艾灸對D-半乳糖致衰老大鼠血清褪黑素含量及其晝夜節律性的影響，中國針灸，2004；24（8）：573

[2]林文注，王佩主編，實驗針灸學，上海科學技術出版社，1994

[3]李辭蓉，華興邦，周浩良，等，豚鼠針刺穴位圖譜的研制，上海針灸雜志，1992，11（2）：28-30

[4]王海峰等，原發性帕金森病患者血清神經生長因子測定及其臨床意義，浙江醫學，2004；26（11）：811-813

[5]王子玫等，腦源性神經營養因子與阿爾茨海默病的關系，上海第二醫科大學學報，2004；24（10）：866-869

[6]牟芝蓉，腦源性神經營養因子及其臨床研究進展，生物技術通報，1999；10（2）：148-151

[7]林艷麗，腦源性神經營養因子研究進展，生物技術通訊，2003；14（3）：241-244

[8]李林，老年性癡呆治療藥物研究進展[A].見：盛樹力.老年性癡呆：從分子生物學到臨床診治[C].北京：科學技術文獻出版社，1998：112

[9]黃麗春，耳穴診斷學，科學技術文獻出版社，2004：317～319

[10]羅興中，耳壓療法抗衰老之機理探討，針灸臨床雜志，1994；10（4）：13

[11]湯依群， 何小健， 黃 寶， 等. 六味地黃丸抗氧化作用研究[J ] . 中藥藥理與臨床，2001 ，17（5） ：2 - 3

[12]楊 勝， 張永祥， 呂曉東， 等. 六味地黃活性部位3A的免疫調節作用機理研究[J ] . 中國中西醫結合雜志，2001 ，21（2） ：119 - 122.

[13]周坤福， 王明艷， 趙鳳鳴， 等. 六味地黃丸延緩衰老作用機理的實驗研究[J ] . 江蘇中醫，1999 ，20（1） ：44 - 45.

[14]劉福君， 茄詳斌. 地黃及六味地黃湯（丸） 的免疫藥理及抗腫瘤作用[J ] . 中草藥， 1995 ，27（2） ：116 - 118.

[15]余榕捷等，利用基因芯片研究六味地黃丸對老年大鼠基因表達的影響，中國病理生理雜志，2004 ；20（2） ：260 – 265

[16]朱健，丹參對衰老鼠腦海馬神經細胞凋亡作用的研究，中國老年學雜志，2001；21（1）：46

[17]郝志勇，丹參提取物對氧化衰老模型小鼠的免疫保護作用，哈爾濱商業大學學報，2003；19（3）：254