謝立信：臨床與基礎研究，如何良好互動？

蘇暄

3月14日，正是草長鶯飛、迎春花粲然報春之時。

在這大好春光中，業界專家學者云集于北京大學英杰交流中心，參加第六屆中國眼科學基礎研究大會暨研究生導師論壇。中國工程院院士、山東省眼科研究所所長謝立信教授在開幕發言中指出了眼表重建領域應用基礎研究的發展方向。

眼表重建在中國：高難度挑戰沒商量？

眼表（ocular surface）包括結膜上皮、角膜上皮及淚膜。眼表涉及的解剖部位除了角膜和結膜外，還有眼瞼和淚腺組織。臨床上，眼表疾病（ocular surface disease，OSD）主要是指角膜上皮和結膜上皮的病變。角膜上皮的完整是維持角膜正常功能和視覺質量的關鍵，其穩定性受益于角膜緣基底部干細胞不斷地增殖分化和向心性移動。當各種因素導致角膜緣干細胞的破壞，會引起角膜緣干細胞的衰竭。

謝立信院士認為，眼表疾病是眼科界面臨的棘手疾病之一，其中角膜緣干細胞缺乏是引起眾多眼表疾病的主要原因之一。角膜緣干細胞缺乏常會引起角膜上皮缺損、角膜新生血管、角膜結膜化、角膜潰瘍甚至自溶，嚴重者還會引起瞼球粘連、結膜囊閉鎖，不但影響外觀，有的甚至會引起失明。近年來，由于角膜緣干細胞理論和組織工程技術的完善和發展，眼表疾病的治療也有了較大進展。目前眼表重建手術是治療眼表疾病的重要手段，而干細胞移植則是眼表重建手術中的關鍵，包括自體或同種異體角膜緣干細胞移植、體外培養角膜緣干細胞移植以及口腔黏膜上皮細胞的培養移植。

迄今為止，《新英格蘭醫學雜志》共報道了3篇對眼表重建研究領域十分重要的論文，都是關于干細胞移植重建眼表的臨床研究。2000年，知名眼表疾病專家、臺灣蔡瑞芳醫師在《新英格蘭醫學雜志》發表文章，采用羊膜為載體構建培養的自體重組角膜上皮膜片，對6例單側角膜緣干細胞缺乏患者進行了移植治療，術后5例視力明顯提高。2004年，日本大阪大學眼科學系主任Kohji Nishida教授等改變了載體，用溫敏材料載體構建培養的自體重組口腔黏膜上皮膜片，對4例雙側角膜緣干細胞缺乏患者進行了移植治療，

術后眼表穩定、角膜透明性和視力都有所改善。2010年，意大利Pellegrini教授在細胞培養的載體方面又進行了改進，把載體換成了纖維蛋白膠，構建了自體重組角膜上皮膜片，完成了112例角膜緣干細胞缺乏癥患者的移植治療，其中76.6%的患者角膜恢復了透明，平均隨訪2.91年，其中最長的為5年，部分病例是先改善眼表功能，然后再進行穿透角膜移植手術恢復視力。

從目前的報道來看，培養的干細胞移植成功率多在75%左右，但決定成功率的關鍵是培養的重組上皮膜片中含有一定比例的干細胞，阻擋了新生血管向角膜的生長。在此情況下再做穿透角膜移植術，成功率就會較高。而且，他們選取的病例損傷程度較輕，基本都局限在角膜部位，結膜和其他眼表功能相對正常，沒有明顯的角膜基質和角膜內皮損害，血管膜切除方便；此外，多采用患者自體角膜緣干細胞移植，涉及到的免疫排斥反應問題也比較少。

“國內幾個中心開展的眼表重建手術大多是參考國外的最先進技術，但我國眼表重建手術面臨的臨床科學問題與發達國家明顯不同。患者病情復雜，不但有角膜緣干細胞的缺乏，且結膜和眼瞼都有不同程度的損傷，必須先重建結膜囊，恢復眼表的功能，再進行角膜功能重建，板層角膜移植或穿透角膜移植手術進行復明；此外，患者多為雙眼燒傷，沒有自體角膜緣干細胞可用，這就要求我們用細胞生物學、分子生物學和免疫學的基礎研究來解決這些臨床問題。

既然臨床上需要大的細胞膜片才能重建結膜囊，那么干細胞的體外大量擴增就成為了關鍵問題。有人說，這個細胞膜片可來自患者自體口腔黏膜，但重建結膜囊采用培養的口腔粘膜移植后近期效果很好，2年后，仍有新生血管長入，因為此類培養的上皮組織缺少抗新生血管的因子。這就需要改進干細胞培養的方法，當然目前也有很多細胞生物學和分子生物學的方法，但效率還比較低。我們科研團隊的研究人員采用羊膜作為載體，探索通過加入一種稱為“Rho蛋白激酶抑制劑”的小分子化合物Y-27632，來實現角膜緣干細胞的大量擴增，構建重組角膜上皮膜片，發現其中干細胞的數量和比例均明顯增加。

角膜緣干細胞擴增，要突破更要安全

謝立信院士還介紹說，我們科研團隊擴增培養構建出角膜緣上皮細胞膜片后，首先考慮的不是馬上應用于臨床，而要想到其在臨床應用上的安全性。此前，我們已取得衛生行政部門的臨床應用批件，可開展組織工程化角結膜上皮移植治療技術臨床應用。

目前小分子化合物Y-27632的分子機制明確，已有不少臨床應用的報道證實其使用是安全的，但我們發現其主要功能是提高干細胞的抗氧化能力。既然要移植大的細胞膜片，就要盡量提高其存活能力，使其能在患者眼表很好地存活。首先，我們盡量采用比較成熟的角膜上皮膜片的制備方法和技術，也在很多方面做了改進，羊膜復合角膜緣干細胞膜片的制備方法已獲得國家發明專利。

第二個重點是，經擴增后，上皮細胞膜片里的干細胞數量是否減少，所占比例是否會下降？我們發現，經過Y-27632擴增培養構建的角膜上皮細胞膜片，保持了原代角膜緣干細胞的正常比例，并略有增加。

另外，我們還要觀察，經過擴增培養構建的將投入臨床應用的角膜上皮膜片，是否具有正常角膜上皮細胞的解剖結構和生理特征。對此我們也做了對照研究，發現構建的重組角膜上皮膜片具有與正常角膜上皮類似的結構和功能特征。

最后，我們還要到臨床上去驗證重組角膜上皮膜片的治療效果，結果發現，這些重組的角膜上皮膜片用于重建患者結膜囊的臨床效果非常好，而且對于非常嚴重的患者，我們還可以進行二次移植，多數患者在一到兩次移植后都恢復了較為正常的眼表功能，患者的滿意度很高，因為如此嚴重的疾病目前在其他地方都沒有辦法解決。

培養的角膜緣上皮干細胞臨床應用效果endprint

一次移植

二次移植

眼表重建的機制假說，新謎團待解

謝立信院士說，我們在進行二次干細胞移植或進行穿透角膜移植術時，可以獲得一個病變的血管膜或角膜組織，使用取下的病變組織做進一步的DNA基因分型和干細胞的病理檢測，結合臨床隨訪、術中印跡細胞學檢查，結果發現： 移植后3～60個月，19例角膜組織印跡細胞學檢查和印跡組織和5例受體角膜組織均未檢測到供體DNA，全為受體表型。

這些移植的供體干細胞都去了何處？這給我們又設了一個新的謎團。一些病例3個月內供體DNA是表達的，還有一些病例在3個月至半年、甚至更長時間也有表達，但在一年后基本都找不到供體DNA的表達，都變成了受體自身的表型。

為解釋供體干細胞消失的原因，我們團隊的研究人員提出了三個新的假說：

第一種假說是，干細胞可能來源于受體的骨髓間充質干細胞；也就是說骨髓間充質干細胞受到刺激后，歸巢到角膜組織。此外，我們觀察到植片移植后干細胞的情況，發現眼表環境改善后，歸巢到角膜組織的骨髓間充質細胞明顯增多。

第二種假說是，這一現象是由于受體角膜緣干細胞復蘇而造成。也就是說，自體角膜緣干細胞未完全死亡，只是由于病變的環境使之處于潛伏狀態。當干細胞移植使病情緩解或微環境改善后，有一部分的自體角膜緣干細胞即行復蘇。

第三種假說是，由于是重建結膜囊，殘存的結膜部位仍有干細胞，移植的羊膜載體的角膜上皮膜片為殘存的結膜干細胞提供合適的微環境和移行的支架。為驗證第一種假說，我們進行了小鼠眼部化學傷后骨髓間充質干細胞歸巢到角膜組織的檢測及影響因素分析的實驗研究。我們設計建立了動物模型，進行骨髓功能正常組、骨髓功能動員組和球結膜下注射組三組對照實驗，試圖分析小鼠眼部化學傷后骨髓間充質干細胞歸巢到角膜組織的影響因素。實驗結果顯示，骨髓間充質干細胞有一定的“歸巢效應”，眼表微環境改善后，歸巢到角膜組織的骨髓間充質干細胞明顯增多，并有利于眼表向角膜上皮表型分化，應用粒細胞集落刺激因子進行骨髓動員可以提高歸巢效率；經骨髓動員或球結膜下注射的骨髓間充質干細胞均聚集在角膜緣處，不向角膜中央發生移動。但這是不是移植角膜緣干細胞消失的主要原因？我們分析，通過血液到達角膜緣的干細胞數量非常少，這一想法還有待其他研究來證實。

謝立信院士還指出，由于移植的角膜緣上皮干細胞細胞是來源于同種異體，術后常會面臨免疫排斥反應問題，其主要臨床特征是睫狀充血、角膜周邊部可見環狀上皮排斥線及上皮缺損區，角膜緣處大量新生血管充盈、怒張，臨床診斷并不困難。我們統計免疫排斥反應的發生率為23.3%。此外，通過臨床共聚焦顯微鏡檢查，我們發現在角膜緣和角膜上皮缺損部位可見大量朗格漢斯（Langhans）細胞浸潤；還可以通過免疫印跡細胞學檢查，觀察到角膜周邊和中央CD4、CD8陽性細胞的表達；經抗免疫排斥反應藥物（糖皮質激素、環孢素A）治療有效，眼表穩定。我們總結的角膜緣上皮干細胞移植術后免疫排斥反應病例的文章發表在2013年第5期的Ophthalmology雜志上。

對于眼表重建手術，我們還需要知道的更多，有很多問題要弄清楚，比如干細胞的臨床應用標準的制定，這是基礎向臨床轉化的關鍵；其次要研究移植后干細胞的去向和新的干細胞來源；以及隨訪了解移植角膜緣干細胞的功能究竟是短期還是長期的等諸多問題。這些科學問題都需要我們開展大量的臨床和基礎工作以進一步研究論證。

如何進行高效的科研？

針對怎樣創造科研高效率的問題，謝院士表示，要先在臨床上把科學問題提出來，然后在實驗室進行應用基礎研究，有了應用基礎研究結果，再與臨床問題結合，進行驗證和總結后，投到比較有影響力的學術刊物上。也就是說，首先要善于發現臨床醫學中的科學問題，然后組織科研團隊進行有目的的集中研究，發現科學證據后，再迅速向臨床轉化，同時要重視轉化后的臨床效果、評價及推廣。

我們團隊目前參與了一項973計劃，里面有一只很大的“攔路虎”，就是關于同種異體來源的干細胞移植安全和標準的問題。我國相關部門對此研究的審批過程非常嚴格，難度很大。如果應用自體的干細胞移植較為容易，用自體口腔黏膜可以重建結膜囊，但要重建結膜上皮，恢復眼表的功能還需解決很多問題。而且，如果我們只能使用患者很少的一點自體干細胞進行擴增，就必須要有工程化技術手段來解決，因此需要細胞生物學專家幫助我們解決這個問題。要把臨床應用再次出現的問題逐一解決，這就帶來了很多后續研究，而這些研究不僅需要國家自然科學基金，還需要國家973等大項目的支持。

北京同仁醫院王寧利教授表示，現在學術界注重的是看成果對本行業發展的引領作用，謝院士的文章都是在Ophthalmology、Iovs、Ajo等眼科頂尖雜志發表，其中有的是作為封面文章發表。臨床問題驅動型科研是當前很重要的研究方式。我們呼喚“在思考中開刀，在開刀中思考”的醫生。

謝立信院士就是從臨床問題提練出科學問題，從科學問題、技術問題，找出假說再去驗證。如果我們從角膜緣殘留的細胞中找出干細胞，讓它去擴增成為移植的來源，這可能是最理想的干細胞獲取方式。但對于完全沒有自體干細胞的患者來說，如何獲得干細胞是眼科人亟需解決的問題。這個問題已超越眼科，成為一個大科學問題，需要統籌安排。endprint

一次移植

二次移植

眼表重建的機制假說，新謎團待解

謝立信院士說，我們在進行二次干細胞移植或進行穿透角膜移植術時，可以獲得一個病變的血管膜或角膜組織，使用取下的病變組織做進一步的DNA基因分型和干細胞的病理檢測，結合臨床隨訪、術中印跡細胞學檢查，結果發現： 移植后3～60個月，19例角膜組織印跡細胞學檢查和印跡組織和5例受體角膜組織均未檢測到供體DNA，全為受體表型。

這些移植的供體干細胞都去了何處？這給我們又設了一個新的謎團。一些病例3個月內供體DNA是表達的，還有一些病例在3個月至半年、甚至更長時間也有表達，但在一年后基本都找不到供體DNA的表達，都變成了受體自身的表型。

為解釋供體干細胞消失的原因，我們團隊的研究人員提出了三個新的假說：

第一種假說是，干細胞可能來源于受體的骨髓間充質干細胞；也就是說骨髓間充質干細胞受到刺激后，歸巢到角膜組織。此外，我們觀察到植片移植后干細胞的情況，發現眼表環境改善后，歸巢到角膜組織的骨髓間充質細胞明顯增多。

第二種假說是，這一現象是由于受體角膜緣干細胞復蘇而造成。也就是說，自體角膜緣干細胞未完全死亡，只是由于病變的環境使之處于潛伏狀態。當干細胞移植使病情緩解或微環境改善后，有一部分的自體角膜緣干細胞即行復蘇。

第三種假說是，由于是重建結膜囊，殘存的結膜部位仍有干細胞，移植的羊膜載體的角膜上皮膜片為殘存的結膜干細胞提供合適的微環境和移行的支架。為驗證第一種假說，我們進行了小鼠眼部化學傷后骨髓間充質干細胞歸巢到角膜組織的檢測及影響因素分析的實驗研究。我們設計建立了動物模型，進行骨髓功能正常組、骨髓功能動員組和球結膜下注射組三組對照實驗，試圖分析小鼠眼部化學傷后骨髓間充質干細胞歸巢到角膜組織的影響因素。實驗結果顯示，骨髓間充質干細胞有一定的“歸巢效應”，眼表微環境改善后，歸巢到角膜組織的骨髓間充質干細胞明顯增多，并有利于眼表向角膜上皮表型分化，應用粒細胞集落刺激因子進行骨髓動員可以提高歸巢效率；經骨髓動員或球結膜下注射的骨髓間充質干細胞均聚集在角膜緣處，不向角膜中央發生移動。但這是不是移植角膜緣干細胞消失的主要原因？我們分析，通過血液到達角膜緣的干細胞數量非常少，這一想法還有待其他研究來證實。

謝立信院士還指出，由于移植的角膜緣上皮干細胞細胞是來源于同種異體，術后常會面臨免疫排斥反應問題，其主要臨床特征是睫狀充血、角膜周邊部可見環狀上皮排斥線及上皮缺損區，角膜緣處大量新生血管充盈、怒張，臨床診斷并不困難。我們統計免疫排斥反應的發生率為23.3%。此外，通過臨床共聚焦顯微鏡檢查，我們發現在角膜緣和角膜上皮缺損部位可見大量朗格漢斯（Langhans）細胞浸潤；還可以通過免疫印跡細胞學檢查，觀察到角膜周邊和中央CD4、CD8陽性細胞的表達；經抗免疫排斥反應藥物（糖皮質激素、環孢素A）治療有效，眼表穩定。我們總結的角膜緣上皮干細胞移植術后免疫排斥反應病例的文章發表在2013年第5期的Ophthalmology雜志上。

對于眼表重建手術，我們還需要知道的更多，有很多問題要弄清楚，比如干細胞的臨床應用標準的制定，這是基礎向臨床轉化的關鍵；其次要研究移植后干細胞的去向和新的干細胞來源；以及隨訪了解移植角膜緣干細胞的功能究竟是短期還是長期的等諸多問題。這些科學問題都需要我們開展大量的臨床和基礎工作以進一步研究論證。

如何進行高效的科研？

針對怎樣創造科研高效率的問題，謝院士表示，要先在臨床上把科學問題提出來，然后在實驗室進行應用基礎研究，有了應用基礎研究結果，再與臨床問題結合，進行驗證和總結后，投到比較有影響力的學術刊物上。也就是說，首先要善于發現臨床醫學中的科學問題，然后組織科研團隊進行有目的的集中研究，發現科學證據后，再迅速向臨床轉化，同時要重視轉化后的臨床效果、評價及推廣。

我們團隊目前參與了一項973計劃，里面有一只很大的“攔路虎”，就是關于同種異體來源的干細胞移植安全和標準的問題。我國相關部門對此研究的審批過程非常嚴格，難度很大。如果應用自體的干細胞移植較為容易，用自體口腔黏膜可以重建結膜囊，但要重建結膜上皮，恢復眼表的功能還需解決很多問題。而且，如果我們只能使用患者很少的一點自體干細胞進行擴增，就必須要有工程化技術手段來解決，因此需要細胞生物學專家幫助我們解決這個問題。要把臨床應用再次出現的問題逐一解決，這就帶來了很多后續研究，而這些研究不僅需要國家自然科學基金，還需要國家973等大項目的支持。

北京同仁醫院王寧利教授表示，現在學術界注重的是看成果對本行業發展的引領作用，謝院士的文章都是在Ophthalmology、Iovs、Ajo等眼科頂尖雜志發表，其中有的是作為封面文章發表。臨床問題驅動型科研是當前很重要的研究方式。我們呼喚“在思考中開刀，在開刀中思考”的醫生。

謝立信院士就是從臨床問題提練出科學問題，從科學問題、技術問題，找出假說再去驗證。如果我們從角膜緣殘留的細胞中找出干細胞，讓它去擴增成為移植的來源，這可能是最理想的干細胞獲取方式。但對于完全沒有自體干細胞的患者來說，如何獲得干細胞是眼科人亟需解決的問題。這個問題已超越眼科，成為一個大科學問題，需要統籌安排。endprint

一次移植

二次移植

眼表重建的機制假說，新謎團待解

謝立信院士說，我們在進行二次干細胞移植或進行穿透角膜移植術時，可以獲得一個病變的血管膜或角膜組織，使用取下的病變組織做進一步的DNA基因分型和干細胞的病理檢測，結合臨床隨訪、術中印跡細胞學檢查，結果發現： 移植后3～60個月，19例角膜組織印跡細胞學檢查和印跡組織和5例受體角膜組織均未檢測到供體DNA，全為受體表型。

這些移植的供體干細胞都去了何處？這給我們又設了一個新的謎團。一些病例3個月內供體DNA是表達的，還有一些病例在3個月至半年、甚至更長時間也有表達，但在一年后基本都找不到供體DNA的表達，都變成了受體自身的表型。

為解釋供體干細胞消失的原因，我們團隊的研究人員提出了三個新的假說：

第一種假說是，干細胞可能來源于受體的骨髓間充質干細胞；也就是說骨髓間充質干細胞受到刺激后，歸巢到角膜組織。此外，我們觀察到植片移植后干細胞的情況，發現眼表環境改善后，歸巢到角膜組織的骨髓間充質細胞明顯增多。

第二種假說是，這一現象是由于受體角膜緣干細胞復蘇而造成。也就是說，自體角膜緣干細胞未完全死亡，只是由于病變的環境使之處于潛伏狀態。當干細胞移植使病情緩解或微環境改善后，有一部分的自體角膜緣干細胞即行復蘇。

第三種假說是，由于是重建結膜囊，殘存的結膜部位仍有干細胞，移植的羊膜載體的角膜上皮膜片為殘存的結膜干細胞提供合適的微環境和移行的支架。為驗證第一種假說，我們進行了小鼠眼部化學傷后骨髓間充質干細胞歸巢到角膜組織的檢測及影響因素分析的實驗研究。我們設計建立了動物模型，進行骨髓功能正常組、骨髓功能動員組和球結膜下注射組三組對照實驗，試圖分析小鼠眼部化學傷后骨髓間充質干細胞歸巢到角膜組織的影響因素。實驗結果顯示，骨髓間充質干細胞有一定的“歸巢效應”，眼表微環境改善后，歸巢到角膜組織的骨髓間充質干細胞明顯增多，并有利于眼表向角膜上皮表型分化，應用粒細胞集落刺激因子進行骨髓動員可以提高歸巢效率；經骨髓動員或球結膜下注射的骨髓間充質干細胞均聚集在角膜緣處，不向角膜中央發生移動。但這是不是移植角膜緣干細胞消失的主要原因？我們分析，通過血液到達角膜緣的干細胞數量非常少，這一想法還有待其他研究來證實。

謝立信院士還指出，由于移植的角膜緣上皮干細胞細胞是來源于同種異體，術后常會面臨免疫排斥反應問題，其主要臨床特征是睫狀充血、角膜周邊部可見環狀上皮排斥線及上皮缺損區，角膜緣處大量新生血管充盈、怒張，臨床診斷并不困難。我們統計免疫排斥反應的發生率為23.3%。此外，通過臨床共聚焦顯微鏡檢查，我們發現在角膜緣和角膜上皮缺損部位可見大量朗格漢斯（Langhans）細胞浸潤；還可以通過免疫印跡細胞學檢查，觀察到角膜周邊和中央CD4、CD8陽性細胞的表達；經抗免疫排斥反應藥物（糖皮質激素、環孢素A）治療有效，眼表穩定。我們總結的角膜緣上皮干細胞移植術后免疫排斥反應病例的文章發表在2013年第5期的Ophthalmology雜志上。

對于眼表重建手術，我們還需要知道的更多，有很多問題要弄清楚，比如干細胞的臨床應用標準的制定，這是基礎向臨床轉化的關鍵；其次要研究移植后干細胞的去向和新的干細胞來源；以及隨訪了解移植角膜緣干細胞的功能究竟是短期還是長期的等諸多問題。這些科學問題都需要我們開展大量的臨床和基礎工作以進一步研究論證。

如何進行高效的科研？

針對怎樣創造科研高效率的問題，謝院士表示，要先在臨床上把科學問題提出來，然后在實驗室進行應用基礎研究，有了應用基礎研究結果，再與臨床問題結合，進行驗證和總結后，投到比較有影響力的學術刊物上。也就是說，首先要善于發現臨床醫學中的科學問題，然后組織科研團隊進行有目的的集中研究，發現科學證據后，再迅速向臨床轉化，同時要重視轉化后的臨床效果、評價及推廣。

我們團隊目前參與了一項973計劃，里面有一只很大的“攔路虎”，就是關于同種異體來源的干細胞移植安全和標準的問題。我國相關部門對此研究的審批過程非常嚴格，難度很大。如果應用自體的干細胞移植較為容易，用自體口腔黏膜可以重建結膜囊，但要重建結膜上皮，恢復眼表的功能還需解決很多問題。而且，如果我們只能使用患者很少的一點自體干細胞進行擴增，就必須要有工程化技術手段來解決，因此需要細胞生物學專家幫助我們解決這個問題。要把臨床應用再次出現的問題逐一解決，這就帶來了很多后續研究，而這些研究不僅需要國家自然科學基金，還需要國家973等大項目的支持。

北京同仁醫院王寧利教授表示，現在學術界注重的是看成果對本行業發展的引領作用，謝院士的文章都是在Ophthalmology、Iovs、Ajo等眼科頂尖雜志發表，其中有的是作為封面文章發表。臨床問題驅動型科研是當前很重要的研究方式。我們呼喚“在思考中開刀，在開刀中思考”的醫生。

謝立信院士就是從臨床問題提練出科學問題，從科學問題、技術問題，找出假說再去驗證。如果我們從角膜緣殘留的細胞中找出干細胞，讓它去擴增成為移植的來源，這可能是最理想的干細胞獲取方式。但對于完全沒有自體干細胞的患者來說，如何獲得干細胞是眼科人亟需解決的問題。這個問題已超越眼科，成為一個大科學問題，需要統籌安排。endprint