缺氧、氧化應激對視網膜色素上皮細胞增殖及葡萄糖調節蛋白78表達的影響

李漫麗 戚卉 吳雅臻

葡萄糖調節蛋白(glucose-regulated protein，GRP)78屬于熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)70家族，是內質網上最多的分子伴侶蛋白，被認為是細胞應激反應的標志性分子，并具有保護細胞、抵抗細胞凋亡的作用。GRP78涉及到多種細胞的增殖、存活、轉移等演化過程，目前被廣泛研究[1]。視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細胞能夠分泌一系列細胞因子，調節局部免疫反應，對維持穩定的視網膜免疫環境起重要作用，RPE的異常病理變化在多種視網膜疾病的發生發展過程中起重要作用。本研究通過體外培養人RPE細胞，以氯化鈷(cobalt chloride，CoCl2)誘發缺氧模型[2]、過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)誘發氧化應激模型[3-4]，分別觀察缺氧、氧化應激對RPE細胞增殖活力的影響及GRP78表達的變化，為研究RPE細胞對不同應激的反應機制提供依據，也為GRP78的功能研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1主要材料人RPE細胞株(D407)購自中山眼科中心，GRP78多克隆抗體購自Invotrigen公司，免疫組織化學試劑Biotin SP-HRP Kit、DMEM培養基、小牛血清、胰蛋白酶購自美國Gibco公司，MTT、二甲基亞砜購自美國Sigma公司，細胞培養板購自美國Costar公司。

1.2細胞培養人RPE細胞株(D407)在含體積分數5% CO2的37 ℃培養箱中，用含體積分數10%小牛血清的DMEM培養基進行貼壁培養，用2.5 g·L-1胰蛋白酶進行消化傳代。取對數生長期細胞進行胰蛋白酶消化，用含體積分數10%小牛血清的DMEM培養基將細胞制成100×103mL-1的細胞懸液，分別接種于96孔、6孔培養板內。96孔培養板以每孔20×103個細胞接種，用于四甲基偶氮唑藍(MTT)法測定細胞存活率；6孔培養板中預先放入高壓滅菌過的玻璃蓋玻片，接種細胞密度為2.5×106個·mL-1，每孔2.5 mL細胞懸液，用于細胞爬片行免疫細胞化學染色實驗。……