墨蘭ISSR—PCR反應體系建立及優化

張睿等

摘要：為建立墨蘭的ISSR-PCR反應體系，采用正交試驗分析了5個因素

1引言

墨蘭（Cymbidium sinense）花瓣香氣濃郁、花色多變、葉形獨特，是國蘭中株型最大，花莖最長的種類。目前對于墨蘭的研究主要集中在形態學、生理學及孢粉學上，而在分子DNA水平上研究很少[1，2]。ISSR是1994年由Zietkiewiczetal提出的一種新型分子標記技術[3]，該技術在SSR（即簡單序列重復）技術的基礎上有所發展，使實驗操作簡便且迅速，穩定性好，多態性高，現今在基因定位、遺傳作圖、遺傳多樣性、進化以及系統發育等研究中被廣泛應用[4]。不同植物對ISSR-PCR反應體系要求不同，因此在利用ISSR標記之前，必須建立該種植物最適ISSR-PCR反應體系。本研究旨在通過正交試驗分析模板DNA、TagDNA聚合酶、Primer、Mg2+和dNTPs 5個因子在4個水平上對墨蘭ISSR-PCR反應影響，并據此建立墨蘭最適ISSR-PCR反應體系，為利用ISSR標記對其進行后續研究奠定基礎。

2材料與方法

試驗材料墨蘭來源于國家林業局保育重點實驗室。試驗方法包括以下3種。

（1）墨蘭基因組DNA提取。采用改良CTAB法[5]提取墨蘭基因組DNA。

4結語

采用正交試驗分析5個因素（Tag酶濃度、Mg2+濃度、模板DNA濃度、引物濃度、dNTP濃度）在4個水平上對ISSR-PCR反應的影響，結果表明：Tag酶濃度為16U/25μL、Mg2+濃度為24mmol/L、dNTP濃度096 mmol/L、Primer濃度為064μmol/L、DNA濃度32ng/25μL是墨蘭ISSR-PCR最優反應體系。Tag酶用量直接影響擴增反應成功與否，濃度過高造成浪費，但如果Tag酶濃度過低，會導致產物合成效率下降。Mg2+ 濃度主要是通過影響Tag酶活性從而影響PCR反應。dNTP作為PCR反應的原料，濃度太低會使擴增不完全，從而降低PCR產物產量；濃度過高會對Mg2+產生抑制作用，降低Mg2+的有效濃度，影響Tag酶的活力，造成浪費。本試驗驗結果為進一步建立優化、系統的ISSR-PCR反應體系提供了初步的科學數據，利用ISSR分子標記技術對墨蘭進行種質資源鑒定、遺傳多樣性及遺傳圖譜構建等研究奠定了基礎。

參考文獻：

[1] 張孟錦，楊志娟蘭花育種途徑與進展[J]廣東農業科學，2008（2）：120～123

[2] 鄭萬均，傅立國中國植物志[M]第十八卷，1999

[3] Zietkiewicz E，Rafslski A，L abuda DGenome fingerprinting by simple sequence repeat （SSR）-anchored polymerase chain reaction amp lification[J]Genomics，1994（20）：176～183

[4] 王建波ISSR分子標記及其在植物遺傳學研究中的應用[J]遺傳，2002，24（5）：613～616

[5] 孫正海，王錦，李世峰，等滑葉藤ISSR-PCR反應體系的建立及優化[J]云南農業大學學報，2012，27（5）：746～750

[6] 李愛民，秀麟，陳功錫墨蘭解剖學研究[J]熱帶亞熱帶植物學報，2002，10（4）：295～300

[7] 劉塔斯，林麗美，龔力民，等分子標記中植物DNA提取方法的研究進展[J]中南藥學，2005，3（6）：0370～04

[8] 項艷，於安鳳，彭鎮華墨蘭離體快繁研究[J]林業科學研究，2003，16（4）：434～438

[9] 何正文，劉運生，陳立華正交設計直觀分析法優化PCR條件[J]湖南醫科大學學報，1998，23（4）：03～404

[10] 劉峰，顧志敏，陳析豐，等長春花ISSR-PCR反應體系的正交優化[J]安徽農業科學，2010，38（5）：2261～2263

[11] 黃執纓墨蘭花朵發育和衰老生理的初步研究[J]生物學雜志，2008，20（4）：26～28

[12] 嚴華，張冬梅，羅玉蘭，等38種國蘭親緣關系的ISSR分析[J]分子植物育種，2010，8（4）：736～741

[13] 吳振興，王慧中，施農農，等蘭屬植物ISSR遺傳多樣性分析[J]生物科技，1999，30（5）：627～632

[14] 董如何，肖必華，方永水正交試驗設計的理論分析方法及應用[J]安徽建筑工業學院學報：自然科學版，2004，12（6）：103～106

Abstract：In order to establish theISSR-PCR reaction systemofISSR-PCR reactionsystem，this article usesorthogonalexperiment to analyze the influences of fivefactors including Tagenzyme concentration，Mg2+ concentration，DNA templateconcentration，primer concentration，and dNTP concentrationatfourlevelsof the orthogonal teston theCymbidiumISSR-PCRreaction systemThe results show thatwhen Tag enzyme concentrationis 16U/25μl，Mg2+ concentration is 24mmol/L，dNTPconcentration is 096 mmol/L，concentration of primeris 064μmol/L，DNAconcentrationis 80ng/25μl，theISSR-PCRreaction system is optimal

Key words：Cymbidium sinense；ISSR-PCR reactionsystem；optimizationendprint

摘要：為建立墨蘭的ISSR-PCR反應體系，采用正交試驗分析了5個因素

1引言

墨蘭（Cymbidium sinense）花瓣香氣濃郁、花色多變、葉形獨特，是國蘭中株型最大，花莖最長的種類。目前對于墨蘭的研究主要集中在形態學、生理學及孢粉學上，而在分子DNA水平上研究很少[1，2]。ISSR是1994年由Zietkiewiczetal提出的一種新型分子標記技術[3]，該技術在SSR（即簡單序列重復）技術的基礎上有所發展，使實驗操作簡便且迅速，穩定性好，多態性高，現今在基因定位、遺傳作圖、遺傳多樣性、進化以及系統發育等研究中被廣泛應用[4]。不同植物對ISSR-PCR反應體系要求不同，因此在利用ISSR標記之前，必須建立該種植物最適ISSR-PCR反應體系。本研究旨在通過正交試驗分析模板DNA、TagDNA聚合酶、Primer、Mg2+和dNTPs 5個因子在4個水平上對墨蘭ISSR-PCR反應影響，并據此建立墨蘭最適ISSR-PCR反應體系，為利用ISSR標記對其進行后續研究奠定基礎。

2材料與方法

試驗材料墨蘭來源于國家林業局保育重點實驗室。試驗方法包括以下3種。

（1）墨蘭基因組DNA提取。采用改良CTAB法[5]提取墨蘭基因組DNA。

4結語

采用正交試驗分析5個因素（Tag酶濃度、Mg2+濃度、模板DNA濃度、引物濃度、dNTP濃度）在4個水平上對ISSR-PCR反應的影響，結果表明：Tag酶濃度為16U/25μL、Mg2+濃度為24mmol/L、dNTP濃度096 mmol/L、Primer濃度為064μmol/L、DNA濃度32ng/25μL是墨蘭ISSR-PCR最優反應體系。Tag酶用量直接影響擴增反應成功與否，濃度過高造成浪費，但如果Tag酶濃度過低，會導致產物合成效率下降。Mg2+ 濃度主要是通過影響Tag酶活性從而影響PCR反應。dNTP作為PCR反應的原料，濃度太低會使擴增不完全，從而降低PCR產物產量；濃度過高會對Mg2+產生抑制作用，降低Mg2+的有效濃度，影響Tag酶的活力，造成浪費。本試驗驗結果為進一步建立優化、系統的ISSR-PCR反應體系提供了初步的科學數據，利用ISSR分子標記技術對墨蘭進行種質資源鑒定、遺傳多樣性及遺傳圖譜構建等研究奠定了基礎。

參考文獻：

[1] 張孟錦，楊志娟蘭花育種途徑與進展[J]廣東農業科學，2008（2）：120～123

[2] 鄭萬均，傅立國中國植物志[M]第十八卷，1999

[3] Zietkiewicz E，Rafslski A，L abuda DGenome fingerprinting by simple sequence repeat （SSR）-anchored polymerase chain reaction amp lification[J]Genomics，1994（20）：176～183

[4] 王建波ISSR分子標記及其在植物遺傳學研究中的應用[J]遺傳，2002，24（5）：613～616

[5] 孫正海，王錦，李世峰，等滑葉藤ISSR-PCR反應體系的建立及優化[J]云南農業大學學報，2012，27（5）：746～750

[6] 李愛民，秀麟，陳功錫墨蘭解剖學研究[J]熱帶亞熱帶植物學報，2002，10（4）：295～300

[7] 劉塔斯，林麗美，龔力民，等分子標記中植物DNA提取方法的研究進展[J]中南藥學，2005，3（6）：0370～04

[8] 項艷，於安鳳，彭鎮華墨蘭離體快繁研究[J]林業科學研究，2003，16（4）：434～438

[9] 何正文，劉運生，陳立華正交設計直觀分析法優化PCR條件[J]湖南醫科大學學報，1998，23（4）：03～404

[10] 劉峰，顧志敏，陳析豐，等長春花ISSR-PCR反應體系的正交優化[J]安徽農業科學，2010，38（5）：2261～2263

[11] 黃執纓墨蘭花朵發育和衰老生理的初步研究[J]生物學雜志，2008，20（4）：26～28

[12] 嚴華，張冬梅，羅玉蘭，等38種國蘭親緣關系的ISSR分析[J]分子植物育種，2010，8（4）：736～741

[13] 吳振興，王慧中，施農農，等蘭屬植物ISSR遺傳多樣性分析[J]生物科技，1999，30（5）：627～632

[14] 董如何，肖必華，方永水正交試驗設計的理論分析方法及應用[J]安徽建筑工業學院學報：自然科學版，2004，12（6）：103～106

Abstract：In order to establish theISSR-PCR reaction systemofISSR-PCR reactionsystem，this article usesorthogonalexperiment to analyze the influences of fivefactors including Tagenzyme concentration，Mg2+ concentration，DNA templateconcentration，primer concentration，and dNTP concentrationatfourlevelsof the orthogonal teston theCymbidiumISSR-PCRreaction systemThe results show thatwhen Tag enzyme concentrationis 16U/25μl，Mg2+ concentration is 24mmol/L，dNTPconcentration is 096 mmol/L，concentration of primeris 064μmol/L，DNAconcentrationis 80ng/25μl，theISSR-PCRreaction system is optimal

Key words：Cymbidium sinense；ISSR-PCR reactionsystem；optimizationendprint

摘要：為建立墨蘭的ISSR-PCR反應體系，采用正交試驗分析了5個因素

1引言

墨蘭（Cymbidium sinense）花瓣香氣濃郁、花色多變、葉形獨特，是國蘭中株型最大，花莖最長的種類。目前對于墨蘭的研究主要集中在形態學、生理學及孢粉學上，而在分子DNA水平上研究很少[1，2]。ISSR是1994年由Zietkiewiczetal提出的一種新型分子標記技術[3]，該技術在SSR（即簡單序列重復）技術的基礎上有所發展，使實驗操作簡便且迅速，穩定性好，多態性高，現今在基因定位、遺傳作圖、遺傳多樣性、進化以及系統發育等研究中被廣泛應用[4]。不同植物對ISSR-PCR反應體系要求不同，因此在利用ISSR標記之前，必須建立該種植物最適ISSR-PCR反應體系。本研究旨在通過正交試驗分析模板DNA、TagDNA聚合酶、Primer、Mg2+和dNTPs 5個因子在4個水平上對墨蘭ISSR-PCR反應影響，并據此建立墨蘭最適ISSR-PCR反應體系，為利用ISSR標記對其進行后續研究奠定基礎。

2材料與方法

試驗材料墨蘭來源于國家林業局保育重點實驗室。試驗方法包括以下3種。

（1）墨蘭基因組DNA提取。采用改良CTAB法[5]提取墨蘭基因組DNA。

4結語

采用正交試驗分析5個因素（Tag酶濃度、Mg2+濃度、模板DNA濃度、引物濃度、dNTP濃度）在4個水平上對ISSR-PCR反應的影響，結果表明：Tag酶濃度為16U/25μL、Mg2+濃度為24mmol/L、dNTP濃度096 mmol/L、Primer濃度為064μmol/L、DNA濃度32ng/25μL是墨蘭ISSR-PCR最優反應體系。Tag酶用量直接影響擴增反應成功與否，濃度過高造成浪費，但如果Tag酶濃度過低，會導致產物合成效率下降。Mg2+ 濃度主要是通過影響Tag酶活性從而影響PCR反應。dNTP作為PCR反應的原料，濃度太低會使擴增不完全，從而降低PCR產物產量；濃度過高會對Mg2+產生抑制作用，降低Mg2+的有效濃度，影響Tag酶的活力，造成浪費。本試驗驗結果為進一步建立優化、系統的ISSR-PCR反應體系提供了初步的科學數據，利用ISSR分子標記技術對墨蘭進行種質資源鑒定、遺傳多樣性及遺傳圖譜構建等研究奠定了基礎。

參考文獻：

[1] 張孟錦，楊志娟蘭花育種途徑與進展[J]廣東農業科學，2008（2）：120～123

[2] 鄭萬均，傅立國中國植物志[M]第十八卷，1999

[3] Zietkiewicz E，Rafslski A，L abuda DGenome fingerprinting by simple sequence repeat （SSR）-anchored polymerase chain reaction amp lification[J]Genomics，1994（20）：176～183

[4] 王建波ISSR分子標記及其在植物遺傳學研究中的應用[J]遺傳，2002，24（5）：613～616

[5] 孫正海，王錦，李世峰，等滑葉藤ISSR-PCR反應體系的建立及優化[J]云南農業大學學報，2012，27（5）：746～750

[6] 李愛民，秀麟，陳功錫墨蘭解剖學研究[J]熱帶亞熱帶植物學報，2002，10（4）：295～300

[7] 劉塔斯，林麗美，龔力民，等分子標記中植物DNA提取方法的研究進展[J]中南藥學，2005，3（6）：0370～04

[8] 項艷，於安鳳，彭鎮華墨蘭離體快繁研究[J]林業科學研究，2003，16（4）：434～438

[9] 何正文，劉運生，陳立華正交設計直觀分析法優化PCR條件[J]湖南醫科大學學報，1998，23（4）：03～404

[10] 劉峰，顧志敏，陳析豐，等長春花ISSR-PCR反應體系的正交優化[J]安徽農業科學，2010，38（5）：2261～2263

[11] 黃執纓墨蘭花朵發育和衰老生理的初步研究[J]生物學雜志，2008，20（4）：26～28

[12] 嚴華，張冬梅，羅玉蘭，等38種國蘭親緣關系的ISSR分析[J]分子植物育種，2010，8（4）：736～741

[13] 吳振興，王慧中，施農農，等蘭屬植物ISSR遺傳多樣性分析[J]生物科技，1999，30（5）：627～632

[14] 董如何，肖必華，方永水正交試驗設計的理論分析方法及應用[J]安徽建筑工業學院學報：自然科學版，2004，12（6）：103～106

Abstract：In order to establish theISSR-PCR reaction systemofISSR-PCR reactionsystem，this article usesorthogonalexperiment to analyze the influences of fivefactors including Tagenzyme concentration，Mg2+ concentration，DNA templateconcentration，primer concentration，and dNTP concentrationatfourlevelsof the orthogonal teston theCymbidiumISSR-PCRreaction systemThe results show thatwhen Tag enzyme concentrationis 16U/25μl，Mg2+ concentration is 24mmol/L，dNTPconcentration is 096 mmol/L，concentration of primeris 064μmol/L，DNAconcentrationis 80ng/25μl，theISSR-PCRreaction system is optimal

Key words：Cymbidium sinense；ISSR-PCR reactionsystem；optimizationendprint