虎杖提取物對神經病理性疼痛模型大鼠的鎮痛作用研究

唐娟娟

·論著·

虎杖提取物對神經病理性疼痛模型大鼠的鎮痛作用研究

唐娟娟

目的研究虎杖提取物對神經病理性疼痛模型大鼠的鎮痛作用, 并探討其作用機制。方法雄性 SD 大鼠, 隨機分為對照組和坐骨神經縮狹模型(chronic construction injury, CCI)組。CCI術后14 d, 應用Von Frey法測定機械刺激縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold, MWT), 觀察口服不同劑量的虎杖提取物對CCI大鼠機械性痛覺超敏的影響。并考察不同劑量虎杖提取物對CCI大鼠脊髓p-ERK、p-P38水平及小膠質細胞活化的影響。結果虎杖提取物可明顯升高CCI大鼠術側的MWT值(P＜0.05), 而對正常大鼠的MWT值沒有顯著影響(P＞0.05)。同時虎杖提取物可顯著抑制CCI模型大鼠脊髓ERK和p38的磷酸化, 并顯著抑制IBA-1表達增加。結論虎杖提取物對CCI誘導的機械性痛覺超敏具有顯著性的抑制作用, 且鎮痛作用維持時間長于嗎啡, 其機制可能是通過抑制脊髓水平ERK和p38的磷酸化, 及通過抑制小膠質細胞活化而實現。

虎杖提取物；CCI；神經病理性疼痛；小膠質細胞

神經病理性疼痛是一種由神經系統受到損傷或產生病變而導致的慢性疼痛, 其病理機制十分復雜, 臨床上總體療效不佳, 迫切需要尋找新的鎮痛藥物。而中醫鎮痛已有上千年歷史, 在中藥驗方中篩選新的鎮痛藥物并闡明其作用機制可能為神經病理性疼痛的治療提供新思路和先導化合物。

中藥虎杖為蓼科植物虎杖的干燥根莖。中醫認為其利濕退黃, 通常用于血瘀、濕熱諸證。能夠活血散瘀、祛風通絡、清熱利濕等, 主治跌打損傷、風濕痹痛等。虎杖的主要生物活性成分由蒽醌類化合物大黃素、大黃酚、芪類衍生物白藜蘆醇和多種苷類衍生物等組成。現在藥理研究表明, 虎杖提取物具有抑制免疫反應、抗凝、強心、保肝和清除氧自由基等多種作用。有研究提示, 虎杖提取物的抗炎作用, 其作用可能與抑制炎癥介質PGE2和NO的產生并抑制細胞免疫有關［1-3］。同時也有文獻表明, 虎杖提取物可以通過抑制過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPAR-γ)的表達來防治痛風性關節炎［4］。

虎杖提取物是否對神經病理性疼痛具有治療作用, 這方面的研究尚未見報道。本研究制備大鼠坐骨神經慢性壓迫模型(chronic constriction injury of the sciatic nerve, CCI), 考察虎杖提取物對神經損傷造成的機械性痛覺超敏的治療作用并研究其作用機制。

1 材料與方法

1.1藥物 虎杖提取物由中國藥科大學臨床藥學教研室提供, 每克虎杖提取物相當于9.0 g虎杖生藥材。鹽酸嗎啡(沈陽第一制藥廠)。

1.2動物 健康成年雄性SD(sprague-dawley)大鼠, 體重為180～220 g, 由浙江省實驗動物中心提供, 生產許可證號：SCXK(浙)2008-0033。

1.3儀器 足底測試儀Von-Frey測痛儀CA91367(Woodland Hills公司)；電泳儀(美國Biorad公司)。

1.4統計學方法 結果均以( x-±s)表示, 用SPSS 11.5分析軟件進行組間t檢驗, 行為學、免疫印跡以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1神經病理性疼痛大鼠模型的建立 通過寬松結扎大鼠坐骨神經制備CCI神經病理性疼痛模型。術后14 d測定機械性縮足反射閾值(Mechanical Withdrawal Threshold, MWT),較基礎痛閾下降40 %以上者視為CCI模型成功, 可以進行后續實驗。

2.2虎杖提取物對CCI大鼠機械性縮足反射閾值的影響篩選CCI造模成功的大鼠, 于手術后第14天開始給藥。分CCI模型組, 嗎啡組和虎杖提取物治療組, 虎杖提取物治療組又分為2.5 g/kg, 5 g/kg和10 g/kg 3個不同劑量組, 每組6只。灌胃給藥, 測定給藥前0 h和給藥后2 h, 4 h, 8 h和24 h的機械性縮足反射閾值。嗎啡組椎管內注射1次鹽酸嗎啡, 劑量為10 μg/只, 注射體積為20 μl/只, CCI模型組則注射相同體積生理鹽水, 嗎啡組和模型組行為學測定方法同虎杖提取物治療組。

結果顯示：與模型組比較, 虎杖提取物兩個劑量單次給藥后均具有顯著的鎮痛作用, 且具有劑量相關性(P＜0.05), 見圖1, 同時作用時間維持較長, 鎮痛作用＞8 h。而嗎啡給藥4 h后, 其鎮痛基本消失。結果表明：虎杖提取物顯著抑制CCI導致的大鼠機械痛覺過敏, 且鎮痛作用維持時間顯著長于嗎啡。

圖1 虎杖提取物對CCI模型大鼠機械刺激縮足反射閾值的影響

2.3虎杖提取物對正常大鼠機械刺激縮足反射閾值的影響正常SD大鼠18只, 分為溶媒組和虎杖提取物組。虎杖提取物治療組又分為2.5 g/kg, 5 g/kg和10 g/kg三個不同劑量組,每組6只。灌胃給藥, 測定給藥前0 h和給藥后2 h, 4 h, 8 h和24 h的機械性縮足反射閾值。結果表明, 虎杖提取物三個不同劑量對大鼠的MWT均無顯著性影響(P＞0.05), 見圖2。

圖2 虎杖提取物對正常大鼠機械刺激縮足反射閾值的影響

2.4虎杖提取物抑制CCI誘導的大鼠脊髓p38MAPK和ERK磷酸化水平的影響 大量證據顯示絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路的激活在神經病理性疼痛的產生和維持中發揮著重要作用。利用western blotting 方法, 檢測虎杖提取物對CCI誘導的脊髓p38MAPK和ERK磷酸化水平異常升高的影響。

結果顯示：CCI模型下大鼠脊髓組織ERK1/2和p38MAPK磷酸化水平顯著增加, 虎杖提取物高劑量10 g/kg可以顯著抑制CCI誘導的大鼠脊髓組織的ERK1/2和p38MAPK磷酸化水平, 而對基礎的ERK1/2和p38MAPK磷酸化水平沒有顯著影響(P＜0.01), 見圖3。

2.5虎杖提取物抑制CCI誘導的大鼠脊髓小膠質細胞活化近年來的研究證實, 小膠質細胞主導的神經炎癥和神經免疫反應在神經病理性疼痛的發和維持中發揮重要作用。脊髓水平的IBA-1(小膠質細胞的標記)的表達上調可以作為脊髓小膠質細胞的活化的證據。接下來檢測虎杖高劑量10 g/kg干預對CCI導致的脊髓小膠質細胞活化的影響。結果顯示：虎杖可以顯著抑制CCI導致的大鼠脊髓組織IBA-1水平的上調,同時對基礎情況下的IBA-1水平沒有顯著影響(P＜0.01), 見圖3。

圖3 虎杖提取物抑制CCI模型大鼠脊髓ERK、p38MAPK的磷酸化, 抑制IBA-1表達上調( x-±s, n=6)

3 討論

大量的研究表明：小膠質細胞的異常激活在神經病理性疼痛中發揮著重要作用［5］。神經損傷后, 數小時內小膠質細胞即可活化, 并持續數十天以上。活化的小膠質細胞釋放大量炎性細胞因子如IL - 1β、IL - 6、TNF-α等, 細胞因子MMP-2/9 以及ATP, NO等活性物質。這個活性物質通過作用于痛覺神經元上對應的受體或信號級聯通路, 導致脊髓中樞敏化, 促進和參與維持神經病理性疼痛［6-8］。椎管內給予小膠質細胞的抑制劑米諾環素可以抑制抑制神經損傷導致的機械性痛覺超敏。已經證明, MAPK家族的兩個重要成員p38MAPK 和ERK , 尤其是p38MAPK在神經損傷導致的小膠質細胞激活過程中發揮著重要作用。p38MAPK和ERK抑制劑都有報道可以抑制神經損傷導致的脊髓小膠質細胞活化,并減少促炎細胞因子釋放［9,10］。

本研究中, 首次發現虎杖提取物有以下功能：①顯著抑制CCI導致的大鼠機械痛覺過敏, 且鎮痛作用維持時間較長；②顯著抑制CCI導致的大鼠脊髓水平ERK和p38MAPK的磷酸化異常性升高；③顯著抑制CCI導致的大鼠小膠質細胞異常活化。因此推測虎杖提取物的鎮痛作用可能通過抑制脊髓水平的p38MAPK和ERK異常升高, 進而抑制小膠質細胞活化而實現。與研究結果相類似, Tillu及其同事［11］報道虎杖的主要成分之一, 白藜蘆醇可通過激活AMPK, 進而抑制感覺神經元中ERK信號通路而發揮鎮痛作用。同時研究還發現,兩個不同劑量的虎杖提取物均不影響正常大鼠的基礎機械學痛閾, 說明虎杖提取物對脊髓水平的正常傷害性感受信息調制沒有顯著影響。

嗎啡類藥物被廣泛應用于治療神經病理性疼痛。但是嗎啡的鎮痛作用持續時間相對較短, 為了有效控制疼痛, 需要持續大劑量給藥, 進而帶來成癮, 耐受和胃腸道不良反應等副作用。數據表明, 虎杖提取物雖然在短時的鎮痛效率上不如嗎啡, 但是其鎮痛持續時間顯著優于嗎啡。10 g/kg虎杖提取物的鎮痛持續時間＞8 h, 是5 mg/kg嗎啡的2倍以上。這表明以虎杖作為研究目標, 從中尋找新的鎮痛藥物具有較大潛力。

［1］ 徐新, 李德明, 徐佳薇, 等.虎杖提取物的抗炎作用及對一氧化氮生成的影響.中國醫院藥學雜志, 2013, 33(016):1311-1315.

［2］ 張海防, 竇昌貴, 劉曉華, 等.虎杖提取物抗炎作用的實驗研究.藥學進展, 2003, 27(4): 230-233.

［3］ 王斌, 侯建平, 李敏, 等.虎杖提取物對急性痛風性關節炎大鼠血清PGE-2的影響.中國中醫基礎醫學雜志, 2009, 14(12): 944-945.

［4］ 侯建平.虎杖提取物對尿酸鈉致痛風性關節炎家兔滑膜組織PPAR-γ的影響.中藥藥理與臨床, 2010, 26(5):76-79.

［5］ Lewis S.Pain: microglia take control in chronic pain.Nat Rev Neurosci, 2013, 14(3): 154-155.

［6］ Meulders A, Vlaeyen JW.Fear reduction in subacute whiplashassociated disorders: the royal road to recovery? Pain, 2013, 154(3): 330-331.

［7］ Gao Y, Liu H, Deng L, et al.Effect of emodin on neuropathic pain transmission mediated by P2X2/3 receptor of primary sensory neurons.Brain Res Bull , 2011, 84(6): 406-413.

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［9］ Piao ZG, Cho IH, Park CK, et al.Activation of glia and microglial p38 MAPK in medullary dorsal horn contributes to tactile hypersensitivity following trigeminal sensory nerve injury.Pain 2006, 121(3):219-231.

［10］ Ma W, Quirion R.The ERK/MAPK pathway, as a target for the treatment of neuropathic pain.Expert Opin Ther Targets , 2005(9):699-713.

［11］ Tillu DV, Melemedjian OK, Asiedu MN, et al.Resveratrol engages AMPK to attenuate ERK and mTOR signaling in sensory neurons and inhibits incision-induced acute and chronic pain.Mol Pain, 2012(8):1-12.

Analgesic effect of polygonum cuspidatum extract in rat model of neuropathic pain

TANG Juan-juan.
Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China

ObjectiveTo study the analgesic effect and mechanism of polygonum cuspidatum extract in the neuropathic pain using rat chronic constriction (CCI) mode.MethodsThe SD rats were randomly divided into control and model groups.After 14 days of CCI, we observe the effect of different doses of polygonum cuspidatum extract on rat mechanical allodynia using vonFrey flinching reflex threshold (mechanical withdrawal threshold, MWT), The levels of p-ERK, p-P38 and the activation of microglial cells in rat spinals were measured by Western blotting.Resultspolygonum cuspidatum extract can significantly increase the value of MWT in CCI rats (P＜0.05), whereas had no significant effect in normal rats (P＞0.05).Meanwhile, polygonum cuspidatum extract significantly inhibited the phosphorylation of ERK and p38, and inhibited the expression of IBA-1 in CCI rat.ConclusionPolygonum cuspidatum extract can inhibit the mechanical allodynia in CCI rat, and the duration is longer than the analgesic effect of morphine.The mechanism may be associated with the inhibition of the phosphorylation of ERK and p38, and inhibition of microglial cell activation in rat spinal.

Polygonum cuspidatum; CCI; Neuropathic pain; Microglial cell

210023 南京中醫藥大學生理學教研室

唐娟娟 E-mail：tangjuanjuan5njmu@126.com