均勻設計法優選酸棗仁抗抑郁有效組分配伍研究＊

趙啟鐸，舒樂新，高 嵐

(天津中醫藥大學，天津 300193)

酸棗仁Zizyphi Spinosi Semen 為鼠李科植物酸棗Ziziphus jujuba Mill.Var. Spinosa (Bunge) HU ex H.F.Chow 的干燥成熟種子[1]，具有補肝、斂汗、寧心、生津之功效，用于虛煩不眠、體虛多汗、驚悸多夢、津傷口渴等證，《本草綱目》將其列為上品。前期研究表明，酸棗仁中抗抑郁作用有效組分為總脂肪油、總黃酮、總皂苷[2-4]。基于中藥復方協同作用，本研究中采用均勻設計法對酸棗仁中3 種抗抑郁作用的主要成分進行配伍研究，以篩選出酸棗仁抗抑郁組分的最佳配伍比例。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物、試藥與儀器

雄性ICR 小鼠，SPF 級，體重(20±2)g，購于天津市山川紅實驗動物科技有限公司，合格證號為SCXK(津)2009-0001，在飼養環境下適應1 周后使用。室溫為(22±2)℃，相對濕度為65% ～70%。光照12 h，自由攝食、飲水。

炒酸棗仁(天津中新藥業集團有限公司)，經天津中醫藥大學藥學院中藥鑒定教研室張麗娟教授鑒定)，自行提取，分離得到總脂肪油(SY)、總黃酮(SH)、總皂苷(SZ)備用;鹽酸氯米帕明片(北京諾華制藥有限公司，批號為X0026，規格為每片25 mg)，用前用2%吐溫-80 水溶液配制成1 g/L，備用。

試驗材料懸尾裝置自制，木棒上用木板隔離成4 個分區，用膠帶固定鼠尾;強迫游泳所需的2 000 mL 燒杯7 個;BP 211D 型萬分之一分析天平(上海君達儀器廠);秒表(瑞士霍耶爾- 奧利達斯廠)。

1.2 方法

1.2.1 分組與給藥

將提取的酸棗仁總脂肪油、總黃酮、總皂苷3 種抗抑郁的有效組分作為考察因素，每個因素各設7 個水平(見表1)，按均勻設計表U7 ×(76)及其使用表進行安排，共得7 種組方，具體配伍見表2。以前期研究[1-3]的有效劑量為依據，分別確定劑量范圍為總脂肪油10 ～100 mg/kg，總黃酮10 ～100 mg/kg，總皂苷10 ～100 mg/kg。

表1 因素水平表(mg/kg)

表2 灌胃給藥方案(mg/kg)

取ICR 小鼠90 只，隨機分為9 組，每組10 只，按表2 設計的劑量灌胃給藥，同時設空白對照組(KB 組)和鹽酸氯米帕明(25 mg/kg)陽性對照組(YX 組)，給藥體積為10 mL/kg，每日1 次，連續給藥7 d。

1.2.2 不同配伍的酸棗仁有效組分藥效學評價

小鼠強迫游泳試驗:參照文獻[5]。將單個小鼠放入水深10 cm燒杯(直徑13 cm，高19.5 cm)中，水溫(25 ±2)℃。觀察6 min，記錄后4 min 小鼠游泳的不動時間(指小鼠在水中停止掙扎，或顯漂浮狀態，僅有微小的肢體運動以保持頭部浮在水面)。試驗結束將小鼠放在取暖設備下烘干，放回籠內。

小鼠懸尾試驗:參照文獻[6]。強迫游泳試驗小鼠飼養3 d，每天灌胃給藥1 次，末次給藥后1 h，將單個小鼠尾端(在距尾2 cm處)用膠布粘在木棒上部，使其成倒掛狀態，頭部離臺面15 cm，中間以擋板隔離小鼠視線。小鼠為了克服不正常體位而掙扎活動，活動一段時間后出現間斷性不動，顯示失望狀態。觀察6 min，記錄后4 min 內小鼠不動時間為失望時間。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 對小鼠強迫游泳和懸尾試驗不動時間的影響

結果見表3 和圖1。

表3 各組小鼠強迫游泳和懸尾試驗結果(± s，n=10)

表3 各組小鼠強迫游泳和懸尾試驗結果(± s，n=10)

注:與KB 組比較，＊P ＜0.05，▲P ＜0.01。

組別KB 組A 組B 組C 組D 組E 組F 組H 組YX 組強迫游泳不動時間(s)165.1 ±26.9 126.8 ±48.4＊127.9 ±48.4＊127.1 ±41.3＊128.4 ±36.3 129.8 ±36.8 127.4 ±30.4＊123.5 ±38.1＊125.8 ±35.4＊懸尾不動時間(s)106.7 ±29.4 79.5 ±19.4＊78.3 ±27.7＊81.9 ±27.3 77.5 ±27.8▲81.1 ±26.1▲78.5 ±18.3＊75.5 ±31.9＊58.3 ±31.2▲

圖1 酸棗仁有效部位不同配伍對小鼠強迫游泳和懸尾試驗不動時間的影響

2.2 總脂肪油、黃酮及皂苷的最優配伍組合

以小鼠強迫游泳不動時間為指標，經二次多項式逐步回歸法對小鼠不動時間試驗數據進行處理，得到抗抑郁藥效(Y)與酸棗仁有效組分配伍之間的關系，方程為 Y1=108 +0.890 X1+0.856 X2-0.249 X3-0.022 1 X1X2(X1為總脂肪油，X2為黃酮，X3為皂苷)，α=0.05，方程調整后r=0.931 0，F=3.255，P=24.9，回歸方程不顯著。

以小鼠懸尾試驗不動時間為指標，經二次多項式逐步回歸法對小鼠不動時間試驗數據進行處理，得到抗抑郁藥效(Y)與酸棗仁有效組分配伍之間的關系，方程為Y2=80.3+0.012 6 X1+0.053 5 X2-0.052 1 X3-0.000 621 X1X2，α=0.05，方程調整后r=0.999 9，F=1 825，P=0.062 2，D- W 統計量d=0.010 0。回歸方程顯著，此方程中各因素最優組合為X1=10 mg/kg，X2=100 mg/kg，X3=10 mg/kg。

2.3 酸棗仁抗抑郁組分配伍方驗證試驗結果

ICR 小鼠40 只，隨機分為4 組，各10 只。分別為對照組、陽性對照組[鹽酸氯米帕明(25 mg/kg)]、酸棗仁抗抑郁組分配伍方組(即總脂肪油10 mg/kg+總黃酮100 mg/kg+總皂苷10 mg/kg)和酸棗仁藥材組(生藥794 mg /kg)。連續給藥7 d，用小鼠懸尾試驗不動時間作為藥效學評價指標。結果見表4 和圖2，酸棗仁抗抑郁組分配伍方和藥材組小鼠懸尾試驗不動時間與對照組相比，差異有統計學意義(P ＜0.05)。抗抑郁組分配伍方組與酸棗仁藥材組相比，小鼠懸尾試驗不動時間縮短，其抗抑郁作用優于藥材組，表明該組分配伍方有較好的抗小鼠試驗性抑郁作用效果。

表4 酸棗仁抗抑郁組分配伍方對小鼠懸尾試驗不動時間的影響(± s，n=10)

表4 酸棗仁抗抑郁組分配伍方對小鼠懸尾試驗不動時間的影響(± s，n=10)

注:與KB 組比較，＊P ＜0.05。

-25 794(生藥)-空白對照組(KB)鹽酸氯米帕明組(YX)酸棗仁藥材組(SYC)酸棗仁配伍方組(SKF)117.60±28.53 69.90±25.83＊80.10±33.98＊70.30±22.89＊)-40.6 31.9 40.2

圖2 酸棗仁抗抑郁組分配伍方對小鼠懸尾試驗不動時間的影響

3 討論

本研究所用總脂肪油、總皂苷、總黃酮提取方法是根據3種有效組分的極性等差異建立的一種系統提取分離法。分別利用石油醚提取法、正丁醇萃取、大孔吸附樹脂分離純化制備各組分。

楊奕等[7]采用均勻設計法對酸棗仁中抗抑郁組分進行了配伍研究，以其中的總生物堿、總黃酮、總皂苷作為研究對象，驗證試驗表明，最佳配伍為總生物堿17.8 mg/kg+總皂苷113.4 mg/kg。筆者的前期研究結果表明，酸棗仁中的脂肪油、總黃酮、總皂苷具有明顯的抗抑郁活性，且均不能增加小鼠自主活動次數，可見其抗抑郁作用和增加小鼠自主活動無關[2-4]，因此采用均勻設計方法對酸棗仁中3 種主要有效組分最佳配伍進行研究。相比傳統的正交設計法，均勻設計在要考察的因素水平較多時，可減少試驗次數，只需要與因素水平數相等次數的試驗即可達到正交設計的試驗效果[8-11]。

本研究所優選的是抗抑郁作用組分配伍關系。通過小鼠強迫游泳試驗及小鼠懸尾試驗，考察小鼠強迫游泳試驗及小鼠懸尾試驗的不動時間，作為評價抗抑郁作用的藥效學指標。試驗結果表明，酸棗仁各有效組分組合均有不同程度的抗抑郁效果。運用相關軟件分析，得出回歸方程，可觀察到各組分對作用效果的貢獻大小及優化用量的信息。統計分析及驗證試驗結果證明，總脂肪油、總皂苷、總黃酮是酸棗仁發揮抗抑郁藥效的有效組分，其組合后的藥效優于藥材組，最優配伍為總脂肪油10 mg/kg+總黃酮100 mg/kg+總皂苷10 mg/kg。

本研究結果與文獻報道的總生物堿17.8 mg /kg +總皂苷113.4 mg /kg 差異很大，可能是由于研究對象不同，在藥效學上的反映不同。對于均勻設計法在中藥有效組分配伍的應用及酸棗仁抗抑郁組分配伍方發揮抗抑郁作用的機理，有待深入研究。

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