31 種中藥單體對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的抗菌作用研究

傅若秋，盧來春，李卓恒，余 瓊，張雪梅

(1. 中國人民解放軍第三軍醫大學第三附屬醫院，重慶 400042; 2. 西南大學園藝園林學院，重慶 400715;3. 重慶醫科大學醫學檢驗系，重慶 400016)

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)是導致壞死性肺炎、嚴重敗血癥、壞死性筋膜炎等疾病的重要致病菌[1]，嚴重威脅人類健康，其防治已成為全球關注的焦點。萬古霉素是目前臨床上確證對MRSA 最有效的藥物，但許多國家(包括中國)均已發現對萬古霉素耐藥的MRSA[2]。一旦MRSA 發展到對萬古霉素普遍耐藥，MRSA 感染患者將面臨無藥可治的危險境地，因此研究開發針對MRSA 的新型抗菌藥物刻不容緩。天然植物特別是中草藥中蘊含著多種多樣的天然活性物質，從中篩選抗MRSA 藥物有良好的前景。筆者在對31 種中藥單體進行篩選時發現，其中9 種具有抗MRSA 作用，對其進行了抗菌活性初步研究，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

中藥單體:青蒿素(artemisinin)、苦參堿(matrine)、胡椒堿(piperine)、厚樸酚(magnolol)、白秋李醇(patchouialcohol)、齊墩果酸(oleanic acid)、蛇床子素(oosthole)、梔子苷(geniposide)、五味子甲素(schizandrin A)、鹽酸水蘇堿(stachydrine hydrochloride)、二氫楊梅素(dihydromyricetin)、根皮苷(phloridzin)、姜黃素(curcumin)、甜菜堿(betaine)、莽草酸(shikimic acid)、水飛薊賓(silymarin)、秦皮 甲 素 (esculin)、巖 白 菜 素 (bergenin)、原 花 青 素(proanthocyanidins)、熊果酸(vrsolic Acid)、補骨脂素(psoralen)、連翹苷(phillyrin)、楊梅苷(myricetrin)、蘆竹堿(gramine)、胡黃連翹苷Ⅱ(picroside Ⅱ)、獐 芽 菜 苦 苷(swertiamarin)、五 味 子 乙 素(schizandrin B)、花旗松素(taxifolin)、對香豆素(p -coumoric acid)、豆腐果酸(helicid)，均購自四川省維克奇生物科技有限公司;仙鶴草酚B (agrimol B)購于四川成都曼斯特生物科技有限公司。

菌種:MRSA 臨床分離菌株(第三軍醫大學第三附屬醫院檢驗科)。

培養基:Luria-Bertani 培養基(LB，自行配制)，LB 配方為酵母提取物5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，pH=7.2 ～7.4。

藥敏紙片:萬古霉素、頭孢西丁、苯唑西林、頭孢呋辛、四環素、替考拉寧、氯霉素、利福平、紅霉素、頭孢唑啉、環丙沙星、左旋氧氟沙星、青霉素、慶大霉素、克林霉素藥敏紙片，均購自英國OXOID 公司。

瓊脂平板:血瓊脂平板(CN)、M-H 藥敏試驗瓊脂平板(重慶龐通醫療器械有限公司)。

1.2 方法

1.1.1 中藥單體溶液制備

將每種中藥單體用50%的二甲基亞砜(DMSO)配制成4 g/L的溶液，滅菌后置4 ℃冰箱保存備用。臨用前取出，在無菌操作臺上用滅菌的50% DMSO 溶液倍比稀釋至2，1，0.5，0.25，0.125 g/L 6 個質量濃度，備用。

1.2.2 菌液制備

將菌種接種于含LB 培養基的試管中，于37 ℃孵箱中培養約24 h，用培養基調整其吸光度值(OD)值為0.8，再用培養基稀釋1 000 倍，相當于菌液濃度為105 ～106 CFU/mL，備用。

1.2.3 抑菌試驗

MRSA 耐藥性鑒定:采用(K-B)紙片擴散法測試MRSA 對不同抗菌藥物的敏感性。將菌液100 μL 均勻涂于M-H 瓊脂平板上，待干后，分別貼上萬古霉素、頭孢西丁、苯唑西林、頭孢呋辛、四環素、替考拉寧、氯霉素、利福平、紅霉素、頭孢唑林、環丙沙星、左氧氟沙星、青霉素、慶大霉素、克林霉素藥敏紙片，于37 ℃恒溫箱中孵育24 h，測定抑菌環的大小，判斷其對藥物的敏感性。

初篩:于無菌96 孔板中每孔加入菌液160 μL、濃度為4 g/L的中藥單體溶液40 μL，每種中藥單體重復3 次;另取菌液160 μL、50%DMSO 溶液40 μL 作為陽性菌對照孔;取培養基160 μL、50%DMSO 溶液40 μL 作為陰性菌對照孔。于37 ℃孵箱中培養24 h，肉眼觀察培養液澄清者，表明其對應的中藥單體有一定抑菌作用，用于后續試驗。

抑菌或殺菌作用測定:于無菌96 孔板中每孔加入菌液160 μL、分別加入質量濃度為4，2，1，0.5，0.25，0.125 g/L 的中藥單體溶液40 μL(相當于培養體系中單體質量濃度分別為800，400，200，100，50，25 μg/mL)，每種單體每個質量濃度重復3 次;另取菌液160 μL、滅菌的50%DMSO 溶液40 μL，作為陽性菌對照孔;取培養基160 μL、50%DMSO 溶液40 μL，作為陰性菌對照孔。于37℃孵箱中培養24 h。肉眼觀察培養液澄清者表明所對應質量濃度的中藥單體有抑菌作用。將肉眼觀察到的澄清培養液取20 μL 轉種至血平板中，于37 ℃恒溫箱中培養24 h 后觀察結果，血平板中無細菌生長所對應濃度的中藥單體有殺菌作用。計算不同質量濃度的中藥單體對11 株MRSA 的抑菌率和殺菌率。

2 結果

2.1 MRSA 耐藥性鑒定

用頭孢西丁紙片擴散法檢測金黃色葡萄球菌對苯唑西林的耐藥性，可作為臨床實驗室確證MRSA 的一種簡便而有效的方法[3]，采用美國臨床實驗室標準化委員會判斷標準[4]，結果11 株MRSA 均對苯唑西林、頭孢西丁耐藥;此外，11 株MRSA 對其他β-內酰胺類、頭孢菌素類、喹諾酮類、大環內酯類、氨基苷類等常見抗菌藥物均有不同程度的耐藥，符合MRSA 多重耐藥特征。11株MRSA 對常見抗菌藥物的耐藥情況分析見表1。

2.2 初篩結果

31 種中藥單體中有9 種對MRSA 表現出抗菌活性，分別為花旗松素、二氫楊梅素、原花青素、姜黃素、熊果酸、白秋李醇、水飛薊賓、蘆竹堿、楊梅苷。

2.3 抑菌/殺菌作用測定結果

抑菌作用:9 種中藥單體均對11 株MRSA 具有一定的抑菌作用，在質量濃度為800 μg/mL 時對11 株MRSA 的抑菌率大多達100%，但質量濃度為25 μg/mL 時對MRSA 均無抑菌作用。其中花旗松素的抑菌作用最強，在質量濃度為50 μg/mL 時對11 株MARS 的抑菌率即可達100%;其次是二氫楊梅素，在質量濃度為100 μg/mL 時抑菌率也達73%;原花青素在質量濃度為200 μg/mL時抑菌率可達91%。其他單體在質量濃度為200 μg/mL 時對MRSA 基本上無明顯的抑菌作用。結果見表2。

表1 11 株MRSA 對常見抗菌素的耐藥情況分析

表2 9 種中藥單體對11 株MRSA 的抑菌作用測定結果

殺菌作用:9 種具有抗MRSA 作用的中藥單體中只有2 種對MRSA 表現出一定的殺菌作用，分別為花旗松素和二氫楊梅素，且僅在質量濃度為400 μg/mL 及以上才表現出殺菌作用。結果見表3。

表3 2 種中藥單體對11 株MRSA 的殺菌作用測定結果[殺菌株數(%)]

3 討論

中藥成分具有一定的抗MRSA 作用，但大多作用不強[5-6]。本研究中也從31 種中藥單體中發現了9 種對MRSA 有抑菌作用的中藥單體，其中花旗松素作用較強。但所篩選的31 種單體中僅有2 種具有一定的殺菌作用，但殺菌起效濃度較高，因此所發現的幾種天然單體直接的臨床應用價值還不大，對其作進一步結構修飾可能會提高其抑菌作用，因此有必要進行進一步的深入研究開發。

由于本研究中使用的MRSA 菌株數有限，用于計算最低抑菌濃度或半數抑菌濃度所得結果誤差會比較大，因此采用抑菌率和殺菌率來表示中藥單體的抗菌活性，結果更直觀、準確。

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