高效液相色譜法測定活血應痛丸中橙皮苷含量

彭春梅，楊宏昕

(內蒙古自治區人民醫院，內蒙古 呼和浩特 010017)

活血應痛丸為我院醫院制劑，由狗脊(砂燙去毛)、香附(醋制)、沒藥(醋制)、制草烏、蒼術(米泔水制)、陳皮、威靈仙7 味藥材組方，功能壯筋骨、活血脈、祛風利濕，用于血脈凝滯、腰腿疼痛，風濕麻木、關節酸痛，行步艱難。參照2010 年版《中國藥典(一部)》陳皮含量測定方法[1]132及有關文獻，結合產品特點，在原有色譜條件基礎上，經多次試驗，確立了活血應痛丸中陳皮所含橙皮苷的含量測定方法。現報道如下。

1 儀器與試藥

Lab Alliance 高效液相色譜儀;Anastar 色譜工作站。活血應痛丸(自制);橙皮苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為0721-200010);水為二次重蒸水，甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法和結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱:Agilent Zorbax SB-C18柱(250 m×4.6 mm，5 μm)，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;流動相:以甲醇-醋酸-水(35 ∶4 ∶61)，檢測波長:283 nm;柱溫:室溫;流速:1.0 mL/min;進樣量:10 μL。在此條件下，理論塔板數按橙皮苷色譜峰計算不得低于2 000，橙皮苷與其他組分色譜峰均達到基線分離(見圖1)。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 溶液制備

精密稱取橙皮苷對照品適量，以甲醇溶解并配制成每1 mL含0.2 mg 的對照品溶液。取樣品適量，研細，稱取約1.3 g，精密稱定，置索氏提取器中，加石油醚(60 ～90 ℃)80 mL，加熱回流2 ～3 h，棄去石油醚，藥渣揮干，加甲醇80 mL，再加熱回流至提取液無色，放冷，濾過，濾液置100 mL 容量瓶中，用少量甲醇分數次洗滌容器，洗液濾入同一容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾液經(0.45 μm)微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。取不含陳皮的陰性樣品，同法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

陰性干擾試驗:取2.2 項下3 種溶液，按擬訂的色譜條件依法進樣。按質量標準中“橙皮苷含量測定”項下方法操作，對不含陳皮的陰性樣品及空白溶劑進行測定，結果陰性對照品溶液色譜中，在與供試品及對照品溶液色譜中橙皮苷峰保留時間相應位置上無色譜峰，表明方中其他成分對樣品橙皮苷含量測定無干擾(見圖1)。

線性關系考察:精密吸取對照品溶液(0.196 g/L)2，6，10，14，18 μL，分別按擬訂的色譜條件進樣測定，以峰面積積分值為縱坐標、橙皮苷進樣量(μg)為橫坐標繪制標準曲線，計算得回歸方程Y=1 061 471 X+10 567.5，r=0.999 9(n=5)。結果表明，橙皮甘進樣量在0.392 ～3.528 μg 范圍內與峰面積積分值呈良好的線性關系。

穩定性試驗:精密吸取同一供試品溶液10 μL，于0，3，6，9，12 h 時進樣，依法測定。結果峰面積的RSD 為1.79%(n=5)，表明供試品溶液在12 h 內穩定性良好。

精密度試驗:精密吸取同一份供試品溶液10 μL，按擬訂的色譜條件重復進樣5 次，測定峰面積。結果的RSD=1.77%(n=5)，表明儀器精密度良好。

重復性試驗:取同一批樣品(批號為050815)5 份，按供試品溶液制備方法平行處理并測定，計算含量。結果含量平均值為11.03 mg/g，RSD 為1.66%(n=5)，表明方法重復性良好。

加樣回收試驗:精密稱取已知含量為11.03 mg/g(批號為050815)的樣品1.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，以兩份為1組，共3 組，每組分別加入橙皮苷對照品11.2，14.0，16.8 mg，按供試品溶液制備方法制備待測溶液，依法測定含量，計算回收率。結果見表1。

表1 橙皮苷加樣回收試驗結果( n=6)

取3 批中試樣品，依法制備供試品溶液并按擬訂的色譜條件進樣測定。結果見表2。含量限度暫定為:本品含陳皮以橙皮苷(C28H34O15)計，水丸每1 g 不得少于7.0 mg，水蜜丸每1 g 不得少于4.67 mg。

表2 3 批中試樣品含量測定結果

3 討論

3.1 色譜條件選擇

測定波長選擇:稱取橙皮苷對照品適量，配成每1 mL 含0.2 mg的溶液，在200 ～500 nm 波長范圍內掃描，參照2010 年版《中國藥典(一部)》陳皮項下橙皮苷含量測定波長，結合紫外掃描結果，確定檢測波長為283 nm。

耐用性考察[1]附錄36:在擬訂條件下，用3 種不同類型的色譜柱(Discovery，Diamonsil，Zorbax SB-C18)進行試驗，均能得到很好的分離效果，且流動相比例改變時也不影響含量測定結果。

流動相選擇[2]:參照2010 年版《中國藥典(一部)》陳皮項下橙皮苷含量測定方法，確定為甲醇-醋酸-水(35 ∶4 ∶61)。

3.2 提取溶劑選擇

根據橙皮苷易溶于水、甲醇、乙醇的化學性質，以橙皮苷提取量為考察指標進行考察。取本品適量，研細，稱取約1.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入甲醇或乙醇25 mL，稱重，超聲處理(功率250 W，頻率33 kHz)20 min，取出，放冷，稱重(補足原重)，搖勻，濾過，濾液經(0.45 μm)微孔濾膜濾過，依法測定含量。結果甲醇提取量為2.35 mg/g，乙醇提取量為0.26 mg/g，故選擇甲醇為提取溶液。

3.3 提取方法選擇

取本品適量，研細，稱取約1.3 g，精密稱定，分別采用超聲提取[置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，超聲處理(功率250 W，頻率33 kHz)20 min，取出，放冷，濾過，濾液置100 mL容量瓶中]、索氏提取(文中方法)、回流提取(置圓燒瓶中，精密加入甲醇25 mL，加熱駕流30 min，搖勻，濾過，定容至25 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，濾液經(0.45 μm)微孔濾膜濾過，即得供試品溶液，分別注入液相色譜儀中測定，結果超聲、索氏、回流提取方法所得樣品中橙皮苷含量分別為8.85，11.21，1.46 mg/g。可見，索氏提取法提取的樣品橙皮苷含量最高，基本提取完全，可作為試驗的提取條件。

方法學考察結果表明，選用橙皮苷為定量檢測指標以及建立的色譜條件進行測定時，方法靈敏度高、專屬性強、重現性好，可作為活血應痛丸的質量控制方法之一。

[1] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典(一部) [M]. 北京:中國醫藥科技出版社，2010.

[2] 呂貽勝. HPLC 法測定陳皮中橙皮苷含量[J]. 安徽醫藥，2007，11(9):796 -797.