五倍子對草魚白細胞數量和兩種酶活性的影響

董艷珍　肖文淵

摘 要：將12尾草魚置于添加有2.5mg/L濃度的五倍子水體中飼養25d，在試驗前和試驗第5d、10d、15d、20d、25d分別測定草魚的白細胞數量、過氧化氫酶活性和堿性磷酸酶活性。結果表明：草魚白細胞數量隨時間延長先增加后減少，在第20d達到最大值4.55×104個/mm3；血清過氧化氫酶活性變化不明顯，在1.63～1.80U/mL內波動；血清堿性磷酸酶活性隨時間延長而先升高后降低，在第20d達到最大值8.37金氏/100mL。

關鍵詞：五倍子；草魚；白細胞；過氧化氫酶；堿性磷酸酶

中圖分類號 S965.1 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2014）11-132-02

Abstract：12 grass carp were cultured in water with addition of 2.5mg/L of gallnut. Before the test and on the 5d，20d， 15th，20th，and 25d the leukocyte number，activity of serum catalase and alkaline phosphatase of were determined. Results showed that the number of leukocyte of grass carp increased first and then decreased with prolonging of time，and on the 20d it reached the maximum value of 4.55×104/mm3；the change of catalase activity was not significantly，varying from 1.63 to 1.80U/mL；alkaline phosphatase activity increased first and then decreased， and reached the maximum 8.37 Guinness /100mL on the 20d.

Key words：Gallnut；Grass carp；Leukocyte；Catalase；Alkaline phosphatase

草魚肉質鮮嫩，營養價值高，飼料來源廣，生長速度快，是我國池塘、水庫養殖的主要品種之一。但由于池塘水環境、飼料及飼養管理水平等諸多因素的影響，造成草魚養殖中病害頻發，死亡率高，抗生素、促生長劑、殺蟲藥等的大量使用，造成藥物在魚體內大量富集殘留和病原體的抗藥性等不良后果，使水產品質量下降，既危害了人類健康，又污染了環境，嚴重影響了草魚池塘養殖業的健康發展和經濟效益的提高。安全生產無公害水產品已經成為水產養殖業可持續發展的關鍵[1]。中草藥具有來源廣泛、價廉效優、毒副作用小、抗藥性不顯著、不易形成機體藥物殘留和影響水產品質量、提高水產動物免疫力和抗病力等優點，在我國養殖業集約化追求綠色、環保、生態的浪潮推動下，其以提高免疫功能方面的獨特優勢，得到了越來越普遍的推廣和應用，在水產養殖中具有重要意義[2]。

五倍子為五倍子蚜寄生于鹽膚木、青麩楊、紅麩楊上而形成的蟲癭；主要成分為沒食子酸和鞣酸，抗菌范圍廣，是用于治療水產動物細菌性疾病的外用藥[3]。五倍子作為水產動物藥物的報道較多，但多集中在其抗菌活性方面。如鄭曙明等對復方五倍子有效成分進行了分離鑒定及抑菌活性研究 [4]；姜蕾等研究了五倍子對3種致病菌的體外抑菌效果和對魚體急性毒性試驗，得出五倍子具有較強的抑菌殺菌效果[5]。但有關五倍子對草魚免疫機能影響的報道很少，本文主要探究五倍子對草魚白細胞數量、血清過氧化氫酶（CAT）、堿性磷酸酶（AKP）活性的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗魚 試驗用草魚12尾，購自西昌市場，魚體健壯，體長15±1.5cm，體重70±3g。

1.2 試驗藥品 五倍子藥劑：稱取五倍子2g，加水煎煮20min熬制成1L藥液（濃度為2 000mg/L），藥液裝入密閉的試劑瓶中，置于冰箱4℃保存。10%草酸鉀溶液，白細胞稀釋液等。

1.3 試驗儀器 722型分光光度計、75BG型紫外可見光分光光度計、HHW-600型恒溫水箱、可調微量進樣器、RJ-TGL-16GA型高速冷凍離心機。

1.3 試驗魚的飼養管理 將12尾草魚暫養在60cm×45cm×45cm規格的魚缸中，水深30cm，水溫21～24℃，暫養2d后開始試驗。采用多次給藥方式，將五倍子藥液潑灑于魚缸中浸泡魚體，試驗期間五倍子濃度保持在2.5mg/L，每5d采用虹吸法換1/3水并補充藥量至初始濃度，同時加入事先曝氣48h的自來水至30cm處。試驗期間不投餌，試驗前及試驗開始后第5d、10d、15d、20d、25d分別測定草魚的白細胞數量、血清過氧化氫酶活性和堿性磷酸酶活性。

1.4 草魚白細胞數量、CAT及AKP活性的測定

1.4.1 白細胞計數 每次取魚2尾，采用斷尾采血法，將血滴在有0.3mL10%草酸鉀溶液的小燒杯中，混勻，制成抗凝血；用微量吸管吸取20μL抗凝血加入對應的白細胞稀釋液中，輕輕搖勻備用；將白細胞懸濁液充入計數池，室溫中平放3min待細胞下沉后于高倍鏡下下計數。計數四角大方格內白細胞總數。計數室4個大方格容積為1×1×0.1×4=0.4mm3，稀釋倍數為稀釋液體積8mL÷血0.02mL=40倍，計數公式如下：

血液白細胞數（個/mm3）=4個大方格中白細胞數×稀釋倍數÷4個大方格容積

1.4.2 酶活性測定 每次取魚2尾采血，在4℃以3000r/min離心10min，制得血清備用。過氧化氫酶（CAT）活性的測定采用Bruno Stellmach的紫外分光光度法[6]；堿性磷酸酶（AKP）活性的測定采用標準曲線法[6]。endprint

2 結果與分析

2.1 五倍子對草魚白細胞數量的影響 五倍子對草魚白細胞數量的影響見表1。在試驗后20d內白細胞數量呈遞增的趨勢，在第20d達到最大值，為4.55×104個/mm3，在第25d白細胞數目略有下降，為3.96×104個/mm3，但仍高于試驗前數量。說明2.5mg/L濃度的五倍子對草魚白細胞數量的增加有一定的促進作用。

2.3 五倍子對草魚血清堿性磷酸酶活性的影響 五倍子對草魚血清堿性磷酸酶活性的影響見表3。試驗前，草魚血清堿性磷酸酶活性為7.26金氏/100mL；在試驗的前15d草魚血清堿性磷酸酶活性逐漸高，并在第15d達到最大值，為8.37金氏/100mL；15d后，草魚血清堿性磷酸酶活性有所降低，在第20d降為7.89金氏/100mL，在第25d降為7.65金氏/100mL，但整體而言，施藥后草魚血清堿性磷酸酶活性比施藥前有所升高，由此說明，2.5mg/L濃度的五倍子能夠一定程度地提高草魚血清堿性磷酸酶活性。

3 討論

（1）我國五倍子產量較大，分布很廣，便于大規模開發生產，同時五倍子作為傳統中藥積累了大量的藥物配方，五倍子在水產養殖中主要為外用藥，施藥方便。可以預見，隨著五倍子各種活性物質的不斷發現和作用機理的明晰，其在水產養殖上的應用前景將會越來越廣闊，必將產生巨大的經濟效益和社會效益[7]。

（2）白細胞是魚類體內一種能吞噬異物、具有免疫和自我保護能力的物質，當魚類生存的外界環境發生變化，為抵御外來毒害以及更好的適應環境，就會出現白細胞數目大量增多的現象[8]。本試驗中草魚白細胞數目隨時間的變化有所增加，在0d～20d呈逐漸上升趨勢，在20d數目達到最大值，在第25d有所下降，這說明2.5mg/L濃度的五倍子對草魚白細胞數目的增加有一定的促進作用，從而提高魚體免疫機能，達到預防疾病的效果。

（3）過氧化氫酶（CAT）能將細胞代謝所產生的H2O2迅速加以清除，從而保護血紅蛋白、巰基酶、膜蛋白 [1]。本試驗中CAT活性雖在第10d和第20d有不同程度的提高，總體來說，五倍子對草魚血清CAT活性影響不明顯。

（4）堿性磷酸酶（AKP）幾乎存在于身體各種組織中，是膜結合酶，在腸上皮、腎小管、成骨細胞、肝臟及白細胞中尤其豐富。血清中AKP主要來源于肝和骨髓。AKP活性的測定對于機體免疫功能的探究和疾病的預防具有非常重要的意義[1]。本試驗中，在第0d～第15d草魚血清堿性磷酸酶活性有一定程度的提高，在第15d達到最大值，為8.37金氏/mL，在第20d和第25d有所下降。2.5mg/L濃度的五倍子對草魚血清堿性磷酸酶活性有一定的促進作用。

參考文獻

[1]李赫，宋文華，于翔.幾種免疫增強劑對草魚SOD、CAT 及 AKP活性的影響[J].水產學雜志，2010，23（4）：6-9.

[2]齊遵利，張秀文，韓敘.中草藥對水產動物免疫促進作用的研究進展[J].安徽農業科學，2010，38（20）：10 734-10 736.

[3]姜蕾， 鄭曙明.五倍子對鯉魚細菌性敗血癥的藥效試驗初報[J].中國農學通報， 2006，22（5）：460-464.

[4]鄭曙明，黃建軍，吳青等.復方五倍子有效成分的分離鑒定及抑菌活性研究[J].水生生物學報， 2010，34（1）：57-64.

[5]姜蕾， 鄭曙明.五倍子對3種致病菌的體外抑菌和急性毒性試驗[J].水利漁業，2005，25（6）：89-90.

[6]Bruno Stellmach（錢嘉淵 譯）酶的測定方法[M].北京：中國輕工業出版社，1992：168-194.

[7]李秀萍，李春遠，渠桂榮等.五倍子的研究概況[J].中醫藥學報，2002，30（3）：72-74.

[8]田娟，冷向軍，李小勤，等.復方中草藥制劑對草魚生長性能、肌肉成分和血清非特異性免疫的影響[J].安徽農業科學，2008，36（28）：12 282-12 284. （責編：張長青）endprint