薯蕷皂苷元對(duì)人胃癌BGC-823和SGC-7901細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

吳媛媛，崔國(guó)興，馬鐵梁，丁偉良，葛志軍，唐志安

（江蘇大學(xué)附屬宜興醫(yī)院1.消化內(nèi)科，2.中心實(shí)驗(yàn)室，3.重癥醫(yī)學(xué)科，4.中醫(yī)科，江蘇宜興214200）

薯蕷皂苷元對(duì)人胃癌BGC-823和SGC-7901細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

吳媛媛1，崔國(guó)興1，馬鐵梁2，丁偉良2，葛志軍3，唐志安4

（江蘇大學(xué)附屬宜興醫(yī)院1.消化內(nèi)科，2.中心實(shí)驗(yàn)室，3.重癥醫(yī)學(xué)科，4.中醫(yī)科，江蘇宜興214200）

目的：觀察薯蕷皂苷元對(duì)人胃癌BGC-823和SGC-7901細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和凋亡過(guò)程的影響并探討其機(jī)制。方法：采用薯蕷皂苷元處理體外培養(yǎng)的BGC-823和SGC-7901細(xì)胞，用MTT法、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力。用免疫印跡法檢測(cè)BGC-823和SGC-7901細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白BAX、凋亡抑制基因Bcl-2和MAPK信號(hào)通路的Erk1／2、JNK、p38三個(gè)通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果：經(jīng)薯蕷皂苷元處理后，BGC-823和SGC-7901細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力明顯降低，凋亡相關(guān)蛋白BAX明顯升高，Bcl-2的表達(dá)明顯降低；p-p38表達(dá)水平明顯降低，但JNK、p-JNK、Erk1／2、p-Erk1／2和p38的表達(dá)無(wú)明顯變化。結(jié)論：薯蕷皂苷元可能通過(guò)MAPK通路中的p-p38通路影響人胃癌BGC-823和SGC-7901細(xì)胞的生物學(xué)行為。

薯蕷皂苷元；胃癌細(xì)胞；MAPK通路

胃癌發(fā)病年齡逐年趨于年輕化，死亡率在全球排第2位，且具有明顯的地域性，中日韓為高發(fā)區(qū)［1－3］。目前應(yīng)用中醫(yī)藥治療胃癌被廣泛關(guān)注，中藥能緩解各種類型胃癌的臨床癥狀，減輕放、化療的不良反應(yīng)，提高治療率，延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間。MAPK信號(hào)通路是常見的細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和凋亡相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的匯集點(diǎn)，在造血系統(tǒng)腫瘤、上皮性腫瘤、絨癌等的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用［4－5］。

菝葜，別名金剛藤，菝葜屬，有祛風(fēng)利濕、消腫解毒、抗炎鎮(zhèn)痛等藥理活性。薯蕷皂苷元是菝葜中主要的活性成分［6－7］。為了解薯蕷皂苷元是否對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和凋亡能力起作用，并進(jìn)一步探討這一作用是否與MAPK信號(hào)通路有關(guān)，我們觀察了薯蕷皂苷元處理后人胃癌BGC-823和SGC-7901細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和凋亡能力的變化，旨在為胃癌治療尋找不良反應(yīng)少，具有更好治療效果的天然抗癌植物藥提供線索。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人胃癌BGC-823和SGC-7901細(xì)胞由南京醫(yī)科大學(xué)周建偉教授饋贈(zèng)；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司；雙抗（含青霉素10萬(wàn)U／L、鏈霉素100mg／L的青鏈霉素）購(gòu)自南通碧云天公司；RPMI 1640培養(yǎng)基（Hyclone公司）；Transwell小室、基質(zhì)膠（美國(guó)BD公司）；兔抗人JNK、p-JNK、Erk1／2、p-Erk1／2、p38、pp38抗體（美國(guó)Cell Signaling公司）；兔抗人Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2-associated X protein，BAX）和B細(xì)胞白血病／淋巴瘤相關(guān)蛋白（B cell leukemia／lymphoma 2，Bcl-2）抗體（英國(guó)Abcam公司）；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體購(gòu)自碧云天公司；薯蕷皂苷元購(gòu)于Sigma-Aldrich公司（貨號(hào)：S8534-25MG）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人胃癌BGC-823和SGC-7901細(xì)胞，用含10%胎牛血清和雙抗（含青霉素10萬(wàn)U／L、鏈霉素100 mg／L的青鏈霉素）的RPMI 1640培養(yǎng)基置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，胰酶消化傳代。

1.3 MTT法檢測(cè)兩種胃癌細(xì)胞增殖能力

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化，將細(xì)胞以1×105／孔的密度接種于96孔板，每孔設(shè)5個(gè)復(fù)孔，等貼壁后，加入質(zhì)量濃度分別為6.25、12.5、25、50μg／mL的薯蕷皂苷元（藥物組），并設(shè)陰性對(duì)照組（只有培養(yǎng)液，無(wú)薯蕷皂苷元），分別培養(yǎng)24、48、72 h，開始MTT反應(yīng)，570 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)光密度（D）值。根據(jù)D值繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，比較處理前后細(xì)胞生長(zhǎng)速度的變化。

1.4 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲和遷移力

在24孔板的Transwell小室加基質(zhì)膠100μL，鋪于培養(yǎng)小室濾膜上制作人工基底膜（無(wú)基底膜測(cè)遷移能力，有基底膜測(cè)侵襲能力），將100μL密度為2×105／mL的細(xì)胞懸液加入上室，600μL含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基加入下室。培養(yǎng)箱中分別孵育24、48、72 h后進(jìn)行Giemsa染色，200倍光鏡下隨機(jī)選擇9個(gè)視野計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)凋亡及MAPK信號(hào)通路代表性蛋白的表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化，將細(xì)胞以1×105／孔的密度接種于6孔板。待細(xì)胞貼壁后，加入薯蕷皂苷元使其終質(zhì)量濃度為50 μg／mL。提取細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度，隨后電泳，濕法轉(zhuǎn)膜，一抗使用BAX、Bcl-2、Erk1／2、JNK、p38、p-Erk1／2，p-JNK，p-p38抗體，二抗使用AP標(biāo)記的堿性磷酸酶，ECL顯影，底片掃描儀拍照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 薯蕷皂苷元對(duì)胃癌細(xì)胞增殖能力的影響

薯蕷皂苷元作用于BGC-823和SGC-7901細(xì)胞24、48、72 h后，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。從圖1可見，隨薯蕷皂苷元質(zhì)量濃度的增大，細(xì)胞增殖能力逐漸下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但各時(shí)間點(diǎn)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 薯蕷皂苷元對(duì)胃癌BGC-823和SGC-7901細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)50μg／mL薯蕷皂苷元處理后，藥物組胃癌BGC-823和SGC-7901細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少，即遷移及侵襲能力明顯降低，與陰性對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖2）。

2.3 薯蕷皂苷元對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

薯蕷皂苷元處理胃癌BGC-823和SGC-7901細(xì)胞后，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，薯蕷皂苷元處理后的BGC-823和SGC-7901細(xì)胞的BAX蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)（P＜0.01），而Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

2.4 MAPK 3條通路代表性蛋白磷酸化和非磷酸化的表達(dá)

對(duì)MAPK 3條通路的代表性蛋白進(jìn)行免疫印跡分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)薯蕷皂苷元處理后，兩種胃癌細(xì)胞中p-p38的表達(dá)明顯下降（P＜0.05，圖4），而其非磷酸化水平（p38）無(wú)明顯變化，且其他兩條通路JNK和Erk1／2以及磷酸化的JNK和Erk1／2亦無(wú)明顯變化（圖4）。

圖1 不同質(zhì)量濃度薯蕷皂苷元處理后BGC-823和SGC-7901細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

圖2 薯蕷皂苷元對(duì)BGC-823和SGC-7901細(xì)胞遷移和侵襲的影響

圖3 薯蕷皂苷元處理后BGC-823和SGC-7901細(xì)胞BAX蛋白和Bcl-2蛋白的表達(dá)

圖4 薯蕷皂苷元處理后MAPK通路中各通路蛋白表達(dá)水平

3 討論

薯蕷皂苷元等中藥提取物已廣泛應(yīng)用于婦科慢性炎癥的治療以及調(diào)節(jié)免疫、活血化瘀、抗腫瘤等［8－11］。本實(shí)驗(yàn)使用薯蕷皂苷元對(duì)胃癌細(xì)胞進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)其對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移、侵襲能力有一定的影響。

研究發(fā)現(xiàn)薯蕷皂苷元有抗腫瘤活性，對(duì)肝癌SMMC-7721、胃腺癌MGC-803、人宮頸癌HeLa細(xì)胞的抑制作用強(qiáng)于長(zhǎng)春新堿（VCR）［12］。另外，有研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞的增殖有抑制作用，并可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［13］。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣顯示薯蕷皂苷元對(duì)BGC-823和SGC-7901細(xì)胞有相似的影響。

MAPK信號(hào)通路與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和凋亡密切相關(guān)，對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)增殖起至關(guān)重要的作用［14］。在真核細(xì)胞中，主要有Erk1／2、JNK、p38等通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育、凋亡及炎癥反應(yīng)等［15］。實(shí)驗(yàn)表明，抑制p38或ERK1／2均可抑制胃癌MGC-803細(xì)胞的體外生長(zhǎng)與遷徙［16］。另外p38信號(hào)傳導(dǎo)通路參與胃癌的發(fā)生，而且其表達(dá)水平還與胃癌的惡性程度呈正相關(guān)［17－18］。使用MEK抑制劑PD98059可以抑制肝癌細(xì)胞Ras-MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［19］。在薯蕷皂苷元處理后的食管癌細(xì)胞中，pp38蛋白的表達(dá)水平明顯降低［20］。本研究中薯蕷皂苷元處理后的胃癌細(xì)胞中，p-p38蛋白表達(dá)水平明顯降低，而p38和其他兩條通路JNK和Erk1／2的表達(dá)無(wú)明顯變化，提示在胃癌中，薯蕷皂苷元可能通過(guò)p38通路的磷酸化激活起作用，從而調(diào)節(jié)BGC-823和SGC-7901細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲。

綜上所述，薯蕷皂苷元在胃癌BGC-823和SGC-7901細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲過(guò)程中可能是通過(guò)p38通路起作用。這將為尋找新的治療胃癌的天然抗癌藥提供一定的線索。

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Diosgenin affect human gastric cancer BGC-823 and SGC-7901 cells through MAPK pathways

WU Yuan-yuan1，CUIGuo-xing1，MA Tie-liang2，DINGWei-liang2，GE Zhi-jun3，TANG Zhi-an4
（1.Department of Gastroenterology，2.Central Laboratory，3.Department of Critical Care Medicine，4.Department of Traditional Chinese Medicine，the Affiliated Yixing Hospital of Jiangsu University，Yixing Jiangsu 214200，China）

Objective：To discuss the role of diosgenin in the proliferation，invasion，migration and apoptosis of human gastric cancer BGC-823 and SGC-7901 cells via MAPK signaling pathways.M ethods：Human gastric cancer cell lines BGC-823 and SGC-7901 were cultured in vitro and treated with diosgenin.Proliferation rate，cellmigration and invasion weremeasured by MTTmethod via Transwell assay.And protein expression of apoptosis-associated protein（AAP）BAX，apoptosis inhibitor protein Bcl-2 and Erk1／2，JNK and p38 proteins of MAPK pathways were measured by Western Blot.Results：When BGC-823 and SGC-7901 cellswere treated with diosgenin，the proliferation，migration and invasion of BGC-823 and SGC-7901 cellswere significantly decreased.The apoptosis of both cellswas enhanced to a certain extent.As to the correlation of gastric cancer cells and MAPK pathways，we found that p-p38 protein expression level after diosgenin treated was dramatically down-regulated；however，the expression levels of Erk1／2，JNK，p38，p-Erk1／2 and p-JNK were negligible.Conclusion：Diosgenin might affect the proliferation，invasion，migration and apoptosis of human gastric cancer BGC-823 and SGC-7901 cells through p-p38 ofMAPK pathways.

diosgenin；gastric cancer cells；MAPK pathways

R541.75

A

1671－7783（2014）03－0207－04

10.13312／j.issn.1671-7783.y140037

吳媛媛（1986—），女，江蘇宜興人，醫(yī)師，主要從事胃腸腫瘤研究。

2014－02－27 ［編輯］ 陳海林