血清microRNA表達譜對原發性膽汁性肝硬化的診斷價值

潘騰莉，孫莉，周興蓓，陳麗，於學軍，譚友文

（1.江蘇大學臨床醫學院，江蘇鎮江212001；2.鎮江市第三人民醫院肝病科，江蘇鎮江212005）

血清microRNA表達譜對原發性膽汁性肝硬化的診斷價值

潘騰莉1，2，孫莉2，周興蓓2，陳麗2，於學軍2，譚友文2

（1.江蘇大學臨床醫學院，江蘇鎮江212001；2.鎮江市第三人民醫院肝病科，江蘇鎮江212005）

目的：尋找原發性膽汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis，PBC）患者血清中差異表達的microRNAs。方法：首先，將PBC組和健康對照組血清標本各3例各自混合，采用Illumina GAⅡx高通量測序技術分析上述2組樣本，篩選出PBC患者與健康對照者表達差異有統計學意義的miRNAs；其次，采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）對差異表達的miRNAs在擴大標本中進行驗證。最后，預測miRNAs的靶基因并進一步分析其作用。結果：高通量測序技術篩選出143條miRNAs表達差異有統計學意義，其中，22條差異倍數＞2倍。經過qRT-PCR驗證，miR-122，miR-141，miR-34a在PBC組中的表達水平明顯高于對照組，與測序結果表達趨勢一致。靶基因預測結果顯示，在細胞核和細胞質中，miRNAs主要通過與蛋白質結合發揮信號轉導的作用。結論：PBC患者存在差異表達的miRNAs，且其對PBC的診斷有一定的參考價值。

原發性膽汁性肝硬化；miRNA；高通量測序

MicroRNA（miRNA）是長度18～22 bp的核苷酸序列，通過3′UTR區域與宿主mRNA結合，降解或抑制其表達。研究表明，miRNA在機體發育、腫瘤形成和轉移、細胞凋亡和壞死等眾多病理生理過程中發揮著重要的調控作用。其中，研究最多的是miRNA對腫瘤發生發展及預后的調控作用［1－4］。近年來，miRNA與免疫調節機制的作用受到越來越多的關注［5－7］。原發性膽汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis，PBC）是一種原因不明的，以肝內中小膽管淋巴細胞浸潤、小膽管炎性破壞、血清特征性抗線粒體抗體（antimitochondrial antibody，AMA）陽性為特征的進行性非化膿性破壞，主要臨床表現為肝內膽汁淤積，是一種以女性發病為主的慢性自身免疫病［6，8］。研究表明，在環境或遺傳因素的作用下，免疫細胞分化、發育與活化過程中固有的精細調節機制被破壞，導致免疫系統對自身組織產生免疫應答，這是PBC發生與發展的根本原因［9］。但是，具體的發病機制有待于進一步闡明。本研究旨在尋找PBC患者中存在差異表達的miRNA，評估其對PBC的診斷價值，并對其作用機制進行初步闡述。

1 對象和方法

1.1 病例

23例PBC患者和23例健康對照者血清標本均來自于2012年6月至2013年11月鎮江市第三人民醫院的門診與住院患者。對照組為在本院體檢的健康志愿者。其中，隨機選取PBC組和對照組血清標本各3例分別進行混合測序，其余標本用于實時熒光定量PCR（qRT-PCR）驗證。

PBC的診斷標準參照國際診斷指南［9］：肝臟的組織學診斷與PBC一致；膽汁淤積的肝功能試驗；間接免疫熒光法測得抗線粒體抗體（AMA）陽性。

本研究所有標本的收集均通過鎮江市第三人民醫院倫理委員會的同意。所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品采集 患者在初次門診或住院時采集全血5 mL于醫用血清管中（無肝素抗凝），上下輕輕顛倒混勻，立即4℃保存，于2 h內4 000×g，離心10 min。取上層血清至1.5 mL離心管中（無RNA酶），13 000×g，離心2 min。最后將上清液轉移至2 mL離心管中（無RNA酶），每管吸入250μL血清進行分裝，棄血細胞沉淀。置于－80℃長期保存。

1.2.2 總RNA提取與文庫構建 血清RNA的提取按照LCSTRK1001試劑盒說明書操作。小RNA文庫構建采用Illumina Truseq Small RNA Preparation kit試劑盒（LC Sciences）。總RNA鏈接5′接頭和3′接頭后經RT-PCR擴增形成小分子RNA的cDNA文庫，經6%電泳緩沖液變性膠電泳分離，將長度為47 bp的小分子RNA切膠回收。

1.2.3 高通量測序 cDNA純化后經Illumina′s Cluster Station生成DNA簇，然后行Illumina GAⅡx測序。通過SCS v2.8軟件實時分析測序圖片，并使用RTA v1.8.70提取堿基信息。提取的原始序列利用ACGT101-miR v4.2（LC Sciences）軟件分析，生成原始數據庫。為保證篩選到高質量的基因結果，剔除可比對離列數＜10的基因。最后分析PBC組和對照組之間差異表達的miRNA。

1.2.4 miRNA的靶基因預測 采用軟件Miranda和Target Scan在線服務站點輸入共同表達的miRNA進行靶基因預測。

1.3 差異表達miRNA的qRT-PCR驗證

隨機挑選差異表達的miRNA進行驗證，根據經驗以miR-24為內參照［10］。取3μL總RNA進行反轉錄，然后取1.5μL cDNA加入20μL的反應體系中。qRT-PCR反應中樣本均重復3次，然后于Rotor-gene 3000儀器中完成相應的循環。55℃30 s預變性，95℃2 min變性，經過40個95℃15 s、60℃30 s循環后在65℃溶解。miRNA的表達量用Ct值表示。2組差異表達基因的相對表達量用2－△△Ct表示。

1.4 統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析。計量資料用均數±標準差±s）表示，兩組間均數比較采用配對t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基本臨床參數

測序標本中PBC組與對照組的臨床參數見表1。結果顯示，PBC組患者的血清總膽紅素（TBIL）、谷草轉氨酶（AST）、谷丙轉氨酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）、谷氨酰轉肽酶（GGT）的表達水平明顯高于對照組（P均＜0.05）。兩組患者的年齡差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 兩組血清相關指標的比較 n＝3，±s

表1 兩組血清相關指標的比較 n＝3，±s

組別 平均年齡（歲） TBIL（μmol／L） AST（U／L） ALT（U／L） ALP（U／L） GGT（U／L）對照組 31.67±8.02 12.50±1.08 29.00±6.00 27.00±3.61 54.67±13.05 33.67±7.77 PBC組 56.33±9.61 128.87±21.27 162.00±46.00 124.00±12.17 711.33±47.72 751.67±58.53 t值 －2.425 －9.563 －4.675 －10.778 －20.447 －19.403 P值 ＞0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.2 第2代測序結果分析

經過初級分析后，對照組得到4 691 800條原始序列，去除冗余后剩余881 742條，占總序列18.79%；PBC組測得944 362條原始序列，462 263條可比對序列，占總序列48.95%。對兩組可比對數據進行長度分析，顯示序列長度主要集中在19 bp，占總數量的38.85%，符合miRNA的長度分布范圍。見圖1。

2.3 差異表達和新發現miRNA

結果顯示，共143條miRNA表達差異有統計學意義，其中PBC組表達上調105條，表達下調38條。已知的有137條，新發現6條，分別為hsa-miR-3665-p5，hsa-miR-3960-p3，hsa-miR-4508-p5，hsamiR-7641-2-p5，hsa-miR-7641-2-p3，PC-3p-755＿3750。比

圖1 可比對RNA序列長度分布圖

較上述差異序列，差異倍數＞2倍的miRNA有22條，其中，miR-122差異倍數最大，在PBC組中比對照組高8.76倍；其次，miR-34a比對照組高7.26倍，miR-141比對照組高4.98倍；miR-26b是PBC組唯一下調的miRNA，比對照組下調2.49倍。見表2。

表2 兩組差異倍數＞2倍的22條m iRNA序列

2.4 miRNA的qRT-PCR驗證

選取差異倍數較大的3條miRNA（miR-122，miR-34a，miR-141），分別在20、12、18例PBC患者和20名健康對照標本中進行初步驗證。結果顯示，miR-122在PBC患者中的表達量明顯升高，升高21.24倍（t＝18.06，P＜0.000 1），明顯高于測序結果的差異倍數。而miR-141和miR-34a的差異倍數與測序相符，分別為5.51和5.43倍（t＝4.54，P＝ 0.000 8；t＝7.03，P＜0.000 1）。見圖2。

圖2 m iR-122，m iR-141和m iR-34a表達水平的驗證

2.5 靶基因預測

Target Scan human 6.2軟件預測結果顯示，hasmiR-34a共有655個可能的靶基因；Miranda軟件預測has-miR-34a共有1 100個可能的靶基因；Bingo分析顯示，靶基因功能涵蓋生物過程、細胞組分和分子功能三大類生物功能，部分功能預測見圖3。

圖3 m iR-34a靶基因生物過程部分預測結果

3 討論

高通量測序已廣泛應用于小RNA或非編碼RNA（non-coding RNA）研究領域。相對于miRNA基因芯片而言，miRNA測序有更高的數據通量、更豐富的生物信息學分析，同時，不受數據庫和物種的限制，并可檢測到多種未知的miRNA。本研究中，首先對PBC組和對照組血清標本進行混合后采取Illumina GAⅡx高通量測序的方法，經過軟件分析后發現，PBC組和對照組血清中143條miRNA的表達存在差異。該結果提示外周血清miRNA可作為PBC診斷的分子生物標志物。以往對PBC的診斷主要集中在自身免疫抗體AMA陽性以及肝穿刺病理檢查結果陽性。近年來，研究發現miRNA在疾病的診斷方面起著重要作用，尤其在腫瘤的早期診斷［11］、靶向性治療以及判斷預后方面有很大進展［12］。

本研究中檢測到一些在肝臟疾病方面有特殊意義的已知miRNA。miR-122是肝臟特異性表達的miRNA，在慢性乙型肝炎［10］、慢性丙型肝炎［13］和原發性肝癌［14］等疾病中均存在差異表達。本研究證實了miR-122在PBC患者外周血中表達明顯升高。升高倍數的不同可能是由于研究前后采用的方法不同，測序采用的是混合標本，對年齡、病情相似的患者血清混合后進行高通量檢測；而RT-PCR驗證是來自于單獨擴大血清樣本的單一序列檢測。因此，我們推測，miR-122的表達量可能受肝臟損傷嚴重程度的影響，而與引起肝臟損傷致病因素的影響不明顯。miR-141屬于miR-200家族，在引起器官纖維化方面研究較多。本研究中PBC患者外周血清中miR-141的表達變化也可能與其影響膽管細胞上皮間質表型轉變（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的作用有關。另有研究顯示，在低氧致腎小管上皮細胞EMT模型中miR-34a表達下降，予以轉染miR-34a可有效預防低氧導致的EMT，而抑制miR-34a的表達可促進EMT，同時證實這一作用通過Notch信號通路完成［15］。

本研究綜合2種miRNA作用靶基因的結果，推測miRNA在細胞內通過與編碼蛋白質的靶基因結合發揮分子生物功能，包括生物過程、細胞組分、分子功能等。但本研究在原始數據方面尚存在一定的不足，如miRNA靶基因預測軟件數據有較高的假陽性率、相關生物學知識和基因數據尚不全面等，可能影響分析結果，有待進一步研究。

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A pilot study of serum m icroRNA profiles as a novel biomarker for primary biliary cirrhosis

PAN Teng-li1，2，SUN Li2，ZHOU Xing-bei2，CHEN Li2，YU Xue-jun2，TAN You-wen2
（1.School ofClinicalMedicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001；2.Departmentof Liver Diseases，the Third People′s Hospital of Zhenjiang，Zhenjiang Jiangsu 212005，China）

Objective：To screen serum microRNA profiles by high throughput sequencing technology method as diagnostic markers for primary biliary cirrhosis（PBC）.M ethods：First，we employed Illumina GA IIx deep sequencing for the initial screening to indicate the read numbers ofmicroRNAs expression in serum pool of 3 PBC and 3 healthy controls，respectively.Second，qRT-PCR validation study was conducted in more samples.Finally，computer analysiswas conducted to predict target genes and biological functions.Results：Twenty-two miRNAs，whose fold change were greater than 2，were filtered out by high throughput sequencing technology.After qRT-PCR validation，the serum expression levels of miR-122，miR-34a and miR-141 were significantly higher in PBC，consistent with the sequencing results.Target genes of prediction results showed thatmicroRNAs played a role in signal transduction，in the nucleus and cytoplasm，through combined with protein.Conclusion：The distinguishing expressed microRNAs had certain reference value on the diagnosis of PBC.

primary biliary cirrhosis；microRNAs；high-throughput sequencing

R575.22

A

1671－7783（2014）03－0230－05

10.13312／j.issn.1671-7783.y140045

江蘇省自然科學基金資助項目（BK2011515）

潘騰莉（1988—），女，碩士研究生；譚友文（通訊作者），主任醫師，碩士生導師E-mail：tyw915＠sina.com

2014－03－05 ［編輯］劉星星