IL-33／TLR4信號通路在A549細胞上皮 間質轉化中的作用

劉超，鄭金旭，許姣，朱勤，杜傳沖

（江蘇大學附屬醫院呼吸科，江蘇鎮江212001）

IL-33／TLR4信號通路在A549細胞上皮 間質轉化中的作用

劉超，鄭金旭，許姣，朱勤，杜傳沖

（江蘇大學附屬醫院呼吸科，江蘇鎮江212001）

目的：探討IL-33／TLR4信號通路在上皮來源的A549細胞上皮間質轉化中的作用。方法：培養A549細胞，用5 ng／mL的轉化生長因子β1（TGF-β1）刺激A549細胞；在不同時間點（0，12，24，48 h）MTT法檢測TGF-β1對A549細胞增殖的影響；熒光定量PCR方法檢測IL-33信號通路中關鍵因子IL-33，Toll樣受體4（TLR4）基因的表達改變；蛋白質印跡法檢測α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、E鈣黏蛋白（E-cad）、磷酸化蛋白激酶（p-AKT）的動態表達。結果：TGF-β1刺激A549細胞后，細胞增殖無明顯變化（P＞0.05），IL-33表達量先升高，后下降（P＜0.05）；E-鈣黏蛋白表達量逐漸下降，α-SMA表達量逐漸升高，TLR4先升高后下降（P＜0.05）；p-AKT表達量逐漸升高（P＜0.05）。結論：IL-33／TLR4信號通路在A549細胞的上皮 間質轉化中發揮了重要作用。

白細胞介素-33；上皮間充質轉化；Toll樣受體4

特發性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是彌漫性間質性肺疾病的常見類型，病因未明，呈慢性、進行性進展，發病率、致死率均較高，是特發性間質性肺疾病中最常見、最嚴重的一種疾病，平均生存期2～5年，死亡率超過大多數腫瘤，尚無特效藥物治療［1］。上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是肺纖維化發病的一種重要機制，肺泡上皮細胞受各種致病因素的刺激，獲得間質細胞的表型，是成纖維細胞及肌成纖維細胞的重要來源［2］。前期研究已初步證明IL-33／ST2通路在肺纖維化疾病中異常激活［3－4］，作為與ST2受體同一超家族的Toll樣受體4（Toll like receptor 4，TLR4），與ST2有著極其相似的結構，是否也在肺纖維化的發病機制中發揮作用？本實驗旨在通過轉化生長因子β1（TGF-β1）誘導Ⅱ型肺泡上皮來源的A549細胞EMT過程，制備細胞層面的肺纖維化模型，探討IL-33／TLR4信號通路與肺纖維化之間的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

TGF-β1（Perotech公司）；DMSO（Calbiochem公司）；DMEM高糖培養基、胎牛血清（Wisent公司）；PCR試劑盒及逆轉錄試劑盒（TaKaRa公司）；Trizol試劑（Invitrogen公司）；兔抗人E鈣黏蛋白（E-cad）抗體、小鼠抗人α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）抗體（均購自武漢博士德公司）；兔抗人磷酸化蛋白激酶（p-AKT）抗體（CST公司）；兔抗人GAPDH抗體（Santa公司）；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔、兔抗小鼠IgG（Santa公司）；A549細胞購自上海中國科學院細胞庫。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養A549細胞，將其接種于培養瓶中，放置在37℃、5%CO2細胞培養箱中常規培養。

1.2.2 實驗分組 將A549細胞接種于6孔板中，當細胞生長融合至70%～80%時，用無血清培養基饑餓12 h，換新鮮培養基，隨機分組，于細胞培養液中加入TGF-β1，濃度為5 ng／mL［5］。

1.2.3 MTT比色法檢測細胞增殖率 將培養的A549細胞用0.25%的胰酶消化，加入含10%胎牛血清的培養基，調整為2×104／mL的單細胞懸液后，傳代到96孔板，每孔200μL，每組設3個復孔，并設調零孔。加入終濃度為5 ng／mL的TGF-β1處理12，24，48 h，每組取出一塊培養板，每孔加入5 mg／mLMTT 20μL，繼續培養4 h后棄上清，加入150μL DMSO，振蕩10 min，使結晶物充分溶解。以630 nm波長為參考，在酶標儀上490 nm波長處測定各孔光密度值。重復上述實驗過程3次。

1.2.4 PCR檢測TLR4、IL-33基因的表達 用5 ng／mL的TGF-β1刺激細胞，測定不同時間點（0，12，24，48 h）細胞TLR4、IL-33 mRNA相對表達量。將細胞密度為1×105／mL的單細胞懸液接種到6孔板中，每孔加1 mL Trizol，按照其說明書提取細胞總RNA。取收集的RNA用TaKaRa逆轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA。所用引物由上海捷瑞工程有限公司合成。引物序列如下，TLR4上游：5′-AGACCTGTCCCT GAACCCTATGAAC-3′，下游：5′-CTAAACCAGCCAGA CCTTGAATACA-3′；IL-33上游：5′-ATGCCAACAACA AGGAACACTCTG-3′，下游：5′-ATAAACACTCCAGGA TCAGTCTTGC-3′；β-肌動蛋白上游：5′-CCAGGCGTT ATGGTAGGCA-3′，下游：5′-TTCCATATCGTCCCAGTT GGT-3′。

TLR4擴增條件：95℃預變性30 s，1個循環；95℃變性。58℃退火30 s，72℃延伸20 s，40個循環。IL-33擴增條件：95℃預變性30 s，1個循環；95℃變性5 s，58℃退火20 s，72℃延伸15 s，40個循環。內參照β-肌動蛋白擴增條件：95℃預變性30 s，1個循環；95℃變性15 s，58℃退火30 s，72℃延伸15 s，40個循環。結果用2－ΔΔCT法分析。

1.2.5 蛋白質印跡法測定E-cad、α-SMA、p-AKT的蛋白表達 用5 ng／mL的TGF-β1刺激細胞，測定不同時間點（0，12，24，48 h）細胞蛋白表達量的變化。將1×105／mL密度的單細胞懸液接種到6孔板中，每孔2 mL，加入TGF-β1后分別培養0，12，24，48 h，PBS沖洗3次后分別加入100μL含有苯甲基磺酰氟（PMSF）的細胞裂解液，放置冰上，用細胞刮刮下細胞后收集到EP管中，5 min振蕩1次，每次1 min，共4次，使細胞充分裂解；12 000 r／min離心15 min后吸取上清加入新的EP管中，4∶1加入5×上樣緩沖液煮沸5 min，冷卻至室溫后，置于－20℃儲存備用。蛋白上樣后恒壓電泳，電轉至PVDF膜，時間為90 min，5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，孵一抗（1∶1 000）過夜。TBST洗膜3次后，敷HRP標記的二抗（1∶5 000）30 min，再以TBST洗膜3次，于Typhoon掃描儀中成像并記錄，重復上述實驗3次，分析實驗結果。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 TGF-β1對A549細胞增殖的影響

A549細胞在高糖DMEM培養基中能生長，且細胞數量隨時間的延長而增多。加5 ng／mL的TGF-β1培養12，24，48 h后，細胞增殖率分別為0.033 767，0.029 733，0.031 333，各時間點比較差無統計學意義（F＝0.252，P＞0.05）。

2.2 TGF-β1對A549細胞表面標志蛋白的影響

見圖1、表1。隨著刺激時間的延長，與對照組相比較，12，24，48 h的E-鈣黏蛋白表達量逐漸下降（F＝29.332，P＜0.05）；與對照組比較，12，24，48 h的α-SMA表達量逐漸升高（F＝22.279，P＜0.05）。

圖1 TGF-β1對A549細胞E-鈣黏蛋白和α-SMA蛋白表達的影響

表1 TGF-β刺激后A549細胞E-鈣黏蛋白1和α-SMA相對表達

2.3 TGF-β1刺激后A549細胞IL-33基因的表達

TGF-β1刺激A549細胞后IL-33基因呈現先升高后下降趨勢（F＝37.412，P＜0.05）。12、24 h的IL-33基因表達量均明顯高于對照組（P＜0.05），24 h時表達量達到最高，48 h表達量下降但仍然高于對照組，但差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2 TGF-β1刺激后A549細胞IL-33基因表達的變化

2.4 TGF-β1刺激后A549細胞TLR4基因的表達

TGF-β1刺激A549細胞后，TLR4呈先升高后下降趨勢（F＝31.239，P＜0.05）。與對照組相比，差異有統計學意義。12、24 h的TLR4基因的表達量均明顯高于對照組（P＜0.05），在24 h時表達量達到最高，48 h表達量下降但仍高于對照組，但差異無統計學意義。見圖3。

圖3 TGF-β1刺激后A549細胞TLR4基因表達的變化

2.5 TGF-β1刺激后A549細胞p-AKT蛋白的表達

TGF-β1刺激A549細胞后，0，12，24，48 h時p-AKT蛋白相對灰度值為0.073±0.037，0.149± 0.136，0.423±0.119，0.683±0.361，p-AKT蛋白表達水平呈逐漸升高的趨勢（F＝30.737，P＜0.05）。12，24，48 h時p-AKT蛋白表達均明顯高于對照組，見圖4。

圖4 TGF-β1刺激后A549細胞p-AKT蛋白的表達

3 討論

肌成纖維細胞是IPF的重要效應細胞［6］，而上皮細胞的EMT過程是肌成纖維細胞的一個重要來源［7］。A549細胞為肺腺癌細胞，屬上皮來源細胞，具備穩定的肺泡上皮細胞的特征，常被用作肺泡II型細胞的代表實驗細胞。本實驗結果顯示，TGF-β1刺激A549細胞后，上皮細胞標志物E-鈣黏表達量逐漸下降，而間充質細胞表型標志物α-SMA的表達量呈上升趨勢，提示TGF-β1可以誘導A549細胞發生EMT，與本課題組前期研究結果一致［8］。進一步提示，EMT在IPF的發病中發揮重要作用，但EMT的具體機制仍未明確。

Schmitz等［9］在2005年通過測量工具發現IL-33同IL-1和成纖維生長因子具有相同的β三葉草結構，其基因序列、結構與IL-1和IL-18相似，屬于IL-1超家族，在上皮細胞和內皮細胞表達較高，當上述細胞因各種因素受損傷時，IL-33可被動地釋放出來，引起其他細胞的遷移、分化、成熟等生物學效應。本實驗中，IL-33在TGF-β1刺激A549細胞12 h后開始增多，24 h達到最高峰，提示在TGF-β1誘導的A549細胞上皮間質轉化的早期，存在IL-33的高表達。我們推測，TGF-β1所致的A549細胞損傷釋放了損傷相關分子IL-33。IL-33前體為31 000的蛋白，成熟的IL-33是經Caspase-1剪切后產生，分泌出細胞后，作為細胞因子通過IL-1受體家族發揮生物學作用［10］，如ST2等。TLR4也是IL-1受體家族成員之一，與ST2有相似的STI結構，故推測IL-33能夠與TLR4結合而發揮生物學效應。Kurowska-Stolarska等［10］于2009年曾報道過IL-33刺激人巨噬細胞后，TLR2、TLR4表達升高，Liu等［11］也報道了在博來霉素誘導的小鼠肺纖維化模型中TLR2、TLR4的表達升高。本實驗結果顯示經TGF-β1處理過的A549細胞，TLR4 mRNA表達量升高，且趨勢與IL-33的升高趨勢相同，推斷IL-33可通過TLR4發揮生物學作用。

激活的TLR4能夠活化下游分子髓樣分化因子88（MyD88），活化的MyD88能夠募集腫瘤壞死因子受體相關因子6（TRAF6）等，激活經典的TLR4／MyD88信號通路，啟動NF-κB通路和MAPK通路，進而調節細胞的增殖、凋亡等生物學行為［12］。

Lombardo等［13］發現，TLR4還能夠激活PI3K。PI3K激活后，其催化產物與AKT分子中PH結構域結合，使AKT磷酸化，PI3K／AKT通路被激活。p-AKT是AKT的活化形式，可間接反應PI3K的活性［14］。PI3K／AKT信號通路主要作用是抗凋亡。AKT還能通過對NF-κB和p53的間接作用影響細胞存活［14］。AKT通過磷酸化活化為p-AKT，然后激活kB激酶（IKK）導致NF-κB的抑制劑IκB的降解，從而使NF-κB從細胞質中釋放出來進行核轉位，激活其靶基因而促進細胞的存活。本實驗中，p-AKT表達量隨時間的延長逐漸增多，證明PI3K／AKT信號通路被激活。

綜上所述，TGF-β1刺激后A549細胞出現損傷，而在損傷早期IL-33可能作為警報素從細胞中釋放出來，啟動一系列的抗損傷和抗凋亡反應。ST2和TLR4都可作為IL-33的受體，呈競爭關系。活化后的TLR4激活MyD88，逐漸激活下游分子，呈級連反應，最終導致纖維化的形成。然而，細胞信號通路錯綜復雜，本實驗以TGF-β1誘導A549細胞的EMT，揭示了IL-33在EMT過程發揮了作用，為IPF的發病機制的闡述及治療提供了部分新的思路。

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Effect of IL-33／TLR4 signal pathway in inducing A549 cells transition to mesenchymal cells from epithelium in vitro

LIU Chao，ZHENG Jin-xu，XU Jiao，ZHU Qin，DU Chuan-chong
（Department of Respiratory Medicine，the Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001，China）

Objective：To investigate the role andmechanism of IL-33 in the process of turning epithelium-mesenchyme for A549 cellswhich is in one strain of human alveolar epithelial cells.M ethods：To stimulate cultured A549 cellswith TGF-β1（5 ng／mL）.MTT assay was used to assess the proliferation of the A549 cells in response to TGF-β1treatment the dynamic expressions of IL-33／TLR4 mRNA were detected by RT-PCR.Western blotting were employed to examine the mRNA and protein expressions ofα-smooth muscle actin（α-SMA）and E-cad，p-AKT.Results：The data showed that TGF-β1had no obvious effects on the proliferation of A549 cells.Stimulated by TGF-β1，E-cad expression of A549 cells gradually declined.α-SMA expression was higher.p-AKT expression gradually increased.Real-time PCR had shown that expressions of IL-33／TLR4 mRNA increased firstly then decreased gradually.The significant differenceswere observed from 0 h to 24 h，especially on 24 h，compared with control group（P＜0.05）.Conclusion：IL-33／TLR4／PI3K／AKT signal transduction pathway promoted epithelial-mesenchymal transition（EMT）of A549，especially on earlier inflammatory reaction.

IL-33；epithelial-mesenchymal transition；Toll like receptor

R332；R563

A

1671－7783（2014）04－0283－04

10.13312／j.issn.1671-7783.y140076

衛生部科研項目（WKJ2006－2－026）；上海市自然科學基金資助項目（10ZR1422600）

劉超（1987—），男，碩士研究生；鄭金旭（通訊作者），教授，主任醫師，博士生導師，E-mail：jxzh135＠163.com

2014－03－24 ［編輯］何承志