分子標記在菠蘿研究中的應用

馬帥鵬等

摘 要 介紹了分子標記技術在菠蘿上的應用，主要包括種質鑒別、遺傳多樣性、親緣關系、連鎖圖譜構建以及與優良農藝性狀相關的分子標記的獲得等方面的情況，并對存在的問題和應用前景進行了討論。

關鍵詞 分子標記 ；菠蘿 ；應用

分類號 S668.3

Abstract This paper summarizes the application of molecular markers in the research of pineapple，mainly including identification，genetic diversity，genetic map construction，achievement of molecular markers that were closely linked to the target genes. At last，we discuss the problems and prospects of the application.

Keywords molecular markers ； pineapple ； application

菠蘿是鳳梨科（Bromeliaceae）鳳梨屬（Ananas）多年生草本果樹，與荔枝、香蕉、木瓜合稱我國嶺南四大名果。菠蘿在世界熱帶水果中占有重要的位置，其產量僅次于香蕉和柑橘，位居第三[1]。與其它的熱帶果樹相比，菠蘿在利用DNA分子標記技術進行遺傳多樣性、親緣關系以及開發與優良性狀相關標記等領域的研究起步較晚。

目前菠蘿的分類方法有多種，主要依據都是形態特征，而這些形態特征往往容易受到環境的影響。另外，部分栽培品種名稱叫法不一，嚴重阻礙了菠蘿的育種改良。所以選擇一種準確可靠又能真實反映種質特性的分類方法就顯得十分必要。分子標記直接以物種的遺傳物質DNA為研究對象，與傳統的形態學分類相比具有不受取材部位、發育階段和環境條件的影響等優勢。應用分子標記技術從DNA水平對菠蘿種質資源進行整理分析，可為菠蘿的合理利用提供理論依據。本文從分子標記技術在菠蘿中的研究進展和應用前景方面進行綜述討論。

1 分子標記在菠蘿上的應用

1.1 菠蘿品種鑒定

菠蘿原產南美洲，17世紀由葡萄牙人傳入澳門，后陸續傳到廣東、廣西、海南、臺灣等地。在長期的傳播過程中和復雜的文化背景下產生了同名異物或者同物異名的現象，嚴重阻礙了菠蘿種質資源的合理利用和育種進程。分子指紋圖譜直接反映DNA水平上的差異，不受外部環境的影響，具有個體特異性，能夠快速準確地鑒定不同的品種。分子指紋已經對多種果樹進行了有效鑒別，王靜毅等[2]利用SSR建立了部分香蕉的指紋圖譜，祝軍等[3]對蘋果進行AFLP分析并得到了蘋果的指紋圖譜，王壯偉等[4]建立了部分歐美草莓的指紋圖譜，雷天剛等[5]利用SSR和ISSR建立柑橘的DNA指紋圖譜，劉孟軍等[6]利用RAPD成功區分了親緣關系很近的無核小棗和金絲小棗，這說明分子指紋圖譜也可用于遺傳背景非常相似的種質鑒別。童和林等[7]篩選5對多態性較高條帶清晰的SSR引物擴增31份菠蘿種質的DNA片段，根據條帶特征初步構建了菠蘿的SSR分子指紋圖譜，并且利用EP-13、EP-15和EP-20 3對引物就可以將31份菠蘿種質全部區分。張如蓮等[8]利用ISSR分子標記得到了6 個菠蘿品種的特異性擴增帶。劉衛國等[9]利用AFLP確定了在廣東徐聞栽培的夏威夷和無刺卡因以及黃金和多汁為同物異名，夏威夷-2號不是夏威夷品種屬于同名異物。Topik等[10]利用ITS成功地區分了馬來西亞的9個栽培品種。雖然分子指紋圖譜構建的方法可能不同，但在菠蘿的種質鑒別方面已經得到了有效的應用，也成功地區分了同名異物和同物異名。種質的鑒定區分可以合理的定位每份種質資源在該物種系統中的位置，方便種質的篩選利用。分子標記技術成功地區分了不同的種質資源，可以作為品種保護鑒定和新品種登記的重要手段和依據。

1.2 遺傳多樣性和親緣關系分析

菠蘿的遺傳背景比較復雜，摸清不同種質的遺傳多樣性對于菠蘿育種進程有重要的指導意義，尤其在雜交育種親本選擇方面。利用分子標記可以確定親本之間的遺傳差異，選擇親緣關系較遠的父母本進而提高雜交優勢的潛力?？傮w而言，國內外利用分子標記對菠蘿進行研究的報道偏少。Aradhya等[11]利用同工酶對菠蘿進行了聚類和多樣性分析。Fatima等[12]利用RAPD對菠蘿的18份種質進行多樣性分析，共得到148個位點，其中132個具有多態性，多態率達到89.2%。1991年，Noyer等[13]首次將RFLP分子標記應用在菠蘿上。Duval等[14]利用RFLP對食用菠蘿屬的7個種和擬菠蘿屬共301份種質進行了親緣關系和遺傳多樣性評價，結果發現，擬菠蘿屬的供試材料的遺傳多樣性較高，雖然食用菠蘿屬種質在形態學上差別較大，但是遺傳多樣性偏低。研究結果還指出通過對葉綠體DNA限制性位點變異進行研究可以更好地揭示菠蘿和近緣屬的進化演變關系。邱文武等[15]建立并優化了適合菠蘿的SRAP反應體系。竇美安等[16]利用SRAP標記研究了61份菠蘿種質資源的遺傳多樣性，發現菠蘿品種的遺傳多樣性水平較低，在相似系數0.84處將供試材料分成5組，該研究結果基本和形態學分類結果一致，也有部分品種的分類結果和傳統分類結果有差異，可以結合形態學特征綜合考慮更為合理。

隨著DNA分子技術的發展，更加高效的AFLP逐步被采用。Kato等[17]利用AFLP對148份菠蘿種質和14份近緣種進行親緣關系分析，結果發現，相似系數的范圍0.549～0.972，說明供試樣品遺傳多樣性較高，與竇美安等[16]的結果有差異。Paz等[18]研究發現，墨西哥的菠蘿種質資源遺傳多樣性較低，根據形態學分類的結果和AFLP分類的結果很一致。在國內，劉衛國等[19]改良了菠蘿的DAN的提取方法得到了質量較好的DNA并建立優化了AFLP反應體系。2008年劉衛國等[9]又篩選8對引物對39份菠蘿種質進行了AFLP分析，多態性條帶平均為73.1%，相似系數為0.73～0.98，在相似系數0.8處將供試材料分成4組，為供試材料的合理利用提供了理論依據，這也是國內首次將AFLP應用到菠蘿上。童和林等[7]采用SAM法以臺農17號作為實驗材料開發了多態性較高的菠蘿SSR引物，Feng等[20]對開發的SSR引物進行了MISA軟件分析，結果發現在得到的94個位點中有91個二核苷酸重復，3個單核苷酸重復，沒有發現3個及3個以上的核苷酸重復，并篩選到了13對多態性較好的引物，可用于菠蘿遺傳多樣性研究。Shoda等[21]僅利用3對SSR引物就可以將30份菠蘿種質資源區分開來，并且發現供試材料具有較高的遺傳多樣性。Rodrigueza等[22]設計了10對SSR引物對6個主栽品種的DNA樣品進行擴增，得到26個多態性的等位基因，平均每個位點有2.6個等位基因。張如蓮等[8]利用 6對ISSR 引物對 17份菠蘿種質進行了基因組 DNA 多態性分析，共擴增出70個條帶，多態性條帶44條，多態性62.86%。在相似系數約0.1處可將供試材料分成3大類。Vanijajiva[23]篩選9對引物對15個泰國菠蘿品種進行ISSR分析，得到56個條帶其中27個具有多態性，相似系數為0.316～0.968，遺傳多樣性水平較高。Zhang等[24]利用ISSR對40份來自4個不同屬的鳳梨科植物進行了親緣關系分析，得到的結果和按照植物學分類的結果相吻合。綜上所述，他們對菠蘿種質遺傳多樣高低的評價有較大差異，相似系數的范圍也差異明顯，這可能與供試樣品的選擇有關。endprint

1.3 遺傳連鎖圖譜的構建

遺傳連鎖圖譜是基因組研究的基礎，也是基因定位與克隆和分子輔助育種的有效工具。番木瓜[25]、荔枝[26]、蘋果[27]、咖啡[28]、腰果[29]等作物的連鎖圖譜繪制都已完成。2004年Carlier等[30]繪制了菠蘿的第一張連鎖圖譜，后來又進行了大量的改進補充。2012年Carlier等[31]繪制了相對比較完整的菠蘿的遺傳連鎖圖譜，共33個連鎖群，492個位點（348 個AFLP、57個RAPD、25個SCAR、22個ISSR、20個SSR、12個EST-SSR、8個CAPS以及一些形態特征位點）。2013年Sousa和Carlier等[32]又對以前的連鎖圖譜進行了補充，覆蓋位點達到741個，其中包括739個DNA位點、1個同工酶位點和1個編碼葉片無刺的“piping”位點。覆蓋位點從最初的156個發展到739個，基因組的覆蓋率從31.6%發展到約86%?？傮w而言，菠蘿連鎖圖譜的繪制取得了長足的進步，但是農藝性狀的具體分布仍需進一步研究。趙玉輝等[33]根據繪制的荔枝遺傳連鎖圖譜找到了與荔枝的酒石酸、蘋果酸、蔗糖含量和單果重相連鎖的QTL位點并進行了定位。張瑞萍等[34]利用區間作圖法進行了梨的可溶性固形物和果實縱橫徑等的QTL定位，這為菠蘿的QTL定位研究指明了方向。利用目前繪制的菠蘿遺傳連鎖圖譜可對菠蘿以及鳳梨科的其他物種的生理和育種開展大量的研究工作，特別是在分子輔助育種、基因的克隆定位以及QTL領域。

1.4 與優良農藝性狀相關的分子標記鑒定

定位和克隆與重要的經濟性狀相連鎖的基因并對其實施調控是我們進行遺傳改良的重要途徑。果樹農藝性狀基因標記篩選的主要方法包括：混合分離分析法（BSA）、平行芽變分析法（PSA）和已知信息捕捉法（KIH）[35]。通過已獲得的農藝性狀基因的分子標記可以進行基因圖位克隆和輔助育種等多個領域，有力地縮短育種進程，提高育種效率。目前已經篩選出了很多與果樹農藝性狀基因相關的分子標記，如蘋果的抗黑星病基因[36]、開花時間[37]和托葉形態[38]等；桃的果形和酸度[39]等；草莓的紅中柱抗性[40]。菠蘿主要利用無性系保存和繁育，很多新品種是通過芽變選種得到的，母株和芽變植株的基因差別很小，適合采用近等基因系法進行研究。在荔枝研究方面，劉成明等[41]已經對親緣關系非常近的‘懷枝、‘三月紅及其焦核突變體進行了相似的研究并獲得了相關的分子標記?？梢酝ㄟ^集團混合分離分析法對同一菠蘿品種不同個體之間葉緣刺有無的相關基因和抗病基因等進行篩選，也可以通過對已知相近物種標記的保守序列信息進行特異PCR擴增雜交進而獲得菠蘿相應性狀的分子標記。菠蘿的抗寒性和抗病性等重要農藝性狀基因需要進一步地開發挖掘定位并應用到菠蘿的遺傳育種進程中，利用分子標記技術對重要農藝性狀進行定位克隆和早期篩選會是今后研究的一個熱點。

2 存在的問題和前景

根據前人的研究結果發現，栽培菠蘿遺傳基礎狹窄[16]，遺傳多樣性水平較低[9]，種質創新的進程中可以考慮適當引入親緣關系較遠的近緣種。鳳梨科包括56屬3 000種[42]，是一個龐大的資源庫，菠蘿相近物種的挖掘可以有效地進行菠蘿的種質創新利用。野生近緣種可能保存著栽培種沒有或者已經消失的優良基因，是菠蘿育種的寶貴資源。菠蘿后代的性狀分離現象比較明顯，即使同一品種的營養繁殖和組培快繁后代也會出現性狀差異，產生了許多表型突變體，Collins[43]發現40多種葉、花、果實的突變體。分子標記可從分子水平準確地鑒別體細胞的無性變異，Wang等[44]可以利用AFLP輕松區分來自不同細胞系的體細胞胚。

前人利用多種分子標記對菠蘿種質進行了聚類分析，不同的分子標記的結果也有差異。劉衛國[19]和竇美安[16]分別采用AFLP和SRAP對土種無刺的歸屬就出現了分歧，前者將其劃入無刺卡因類后者將其劃入西班牙類。這可能與不同標記的擴增位點差異有關，可以考慮結合植物形態特征合理分類。

隨著分子標記的進一步應用，將會有越來越多的標記用來改進和發展目前的遺傳連鎖圖譜，圖譜的飽和度會變得更高，高密度的遺傳連鎖圖譜對基因的定位克隆和分子輔助育種等都具有重要指導意義。前人已經在其它果樹的高密度的連鎖圖譜和與重要農藝性狀相關分子標記開發利用方面取得了很多可喜的成就，展現了廣闊的發展前景，這是從事菠蘿研究工作者今后努力的方向。

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